维生素是一类维持人体正常生理功能所必需的有机营养素，每种维生素履行着特殊的生理功能，缺乏时将引起相关的营养缺乏症。通常根据它们的溶解性质，将其分为脂溶性维生素(维生素A、维生素D、维生素E等)和水溶性维生素(B族维生素、维生素C等)两大类。

一、维生素A的测定(反相高效液相色谱法)

1．原理

样品皂化后，维生素A抽提至有机溶剂中，经浓缩后，C₃₀或PFP反相液相色谱柱分离，紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。

2．试剂及设备

(1)试剂无水乙醇、抗坏血酸、氢氧化钾、乙醚、石油醚、无水硫酸钠、PH试纸、甲醇、淀粉酶(活力单位≥100U/mg)和2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)。

(2)维生素A标准品视黄醇(纯度≥95%)。

(3)设备高效液相色谱仪(带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器)、磁力加热搅拌器、旋转蒸发器、恒温水浴振荡器、分析天平、分液漏斗、玻璃漏斗、容量瓶(100mL)、标准口三角瓶、移液管(1mL, 10mL)、氮吹仪、定量滤纸。

3．检测步骤

(1)样品处理 取牛乳50mL(或蛋黄5g)于标准口三角瓶中，加乙醇60mL、50%KOH 2mL，接上冷凝管，于磁力搅拌器上加热30min，温度控制在50℃左右。取分液漏斗两个，固定于铁架台上，一个加50mL乙醚或乙烷做第一次提取用，另一个加30mL乙醚做第二次提取用。样品皂化完后，取下三角瓶并用蒸馏水将冷凝管口冲洗，洗液并入三角瓶内，冷却至室温后，慢慢倒入第一个分液漏斗中，并用蒸馏水洗三角瓶2～3次，振摇片刻后静止待分层。取下层液移入第二次提取液中，同上处理后弃去下层。将两次提取液合并，同时将另一漏斗用乙醚冲洗三次，然后用蒸馏水洗涤提取液，以除去KOH和乙醇，直至蒸馏水用pH试纸测试为中性。

在100mL棕色容量瓶中加0.2g BHT，瓶上放漏斗、滤纸及无水Na₂SO₄，将提取液通过无水Na₂SO₄脱水，用乙醚冲洗分液漏斗，最后定容至1000 mL，摇匀待用。取10mL于鸡心瓶中，在50℃恒温水浴中旋转蒸发至干，取下后立即用1.0mL无水甲醇溶解，摇动后上机测定。

(2)色谱条件色谱柱：C₃₀柱(柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径3um)；流动相：A:水；B：甲醇，洗脱梯度见表2-1;紫外检测波长：325 nm；流速：0.8 mL/min ;进样量：10uL;柱温：20℃。

表2-1 C₃₀色谱柱-反相高效液相色谱法洗脱梯度参考条件

(3)标准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素A标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算直线回归方程。

(4)样品测定试样液经高效液相色谱仪分析，测得峰面积，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中，建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。

4．结果计算

试样中维生素A的含量按下式计算：

式中X—试样中维生素A的含量，ug/100g;

p—根据标准曲线计算得到的试样中维生素A的浓度，ug/mL;

V一定容体积，mL ;

f一换算因子(维生素A: f=1；维生素E: f=0.001)；

100—试样中量以每100g计算的换算系数；

m—试样的称样量，g。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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