四、维生素B₁(硫胺素)含量的测定(荧光分光光度法)

1．原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其它荧光物质干扰时，此荧光强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液用于测定。

2.试剂及设备

(1)试剂正丁醇(CH₃CH₂CH₂CH₂OH)，无水硫酸钠(Na₂SO₄) ; 560℃烘烤6h后使用，铁氰化钾[K₃Fe(CN)₆] ,氢氧化钠(NaOH)，盐酸(HC1)，乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)，冰乙酸(CH₃COOH)，人造沸石，硝酸银(AgNO₃)，溴甲酚绿(C₂₁H₁₄Br₄O₅S)，五氧化二磷(P₂O₅)或者氯化钙(CaC1₂)，氯化钾(KC1)，淀粉酶：不含维生素B₁，酶活力≥3700U/g，木瓜蛋白酶：不含维生素B₁,酶活力≥800U(活力单位)/mg。

(2)试剂配制0.1 mol/L盐酸溶液：移取8.5mL盐酸，用水稀释并定容至1000mL,摇匀。

0.01 mol/L盐酸溶液：量取0.1 mol/L盐酸溶液50mL，用水稀释并定容至500mL,摇匀。

2mol/L乙酸钠溶液：称取272g乙酸钠，用水溶解并定容至1000mL，摇匀。

氯化钾溶液(250g/L)：称取250g氯化钾，用水溶解并定容至1000 mL，摇匀。

酸性氯化钾(250g/L)：移取8.5 mL盐酸，用250g/L氯化钾溶液稀释并定容至1000 mL，摇匀。

氢氧化钠溶液(150g/L)：称取150g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL，摇匀。

铁氰化钾溶液(10g/L)：称取1g铁氰化钾，用水溶解并定容至100mL，摇匀，于棕色瓶内保存。

碱性铁氰化钾溶液：移取4mL 10g/L铁氰化钾溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL，摇匀。用时现配，避光使用。

乙酸溶液：量取30mL冰乙酸，用水稀释并定容至1000mL，摇匀。

0.01 mol/L硝酸银溶液：称取0.17g硝酸银，用100mL水溶解后，于棕色瓶中保存。

0.1 mol/ L氢氧化钠溶液：称取0.4 g氢氧化钠，用水溶解并定容至100 mL，摇匀。

溴甲酚绿溶液(0.4g/L)：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。

活性人造沸石：称取200g0.25mm (40目)～0.42mm (60目)的人造沸石于2000 mL试剂瓶中，加入10倍于其体积的接近沸腾的热乙酸溶液，振荡10min，静置后，弃去上清液，再加入热乙酸溶液，重复一次；再加入5倍于其体积的接近沸腾的热250g/L氯化钾溶液，振荡15 min，倒出上清液；再加入乙酸溶液，振荡10min，倒出上清液；反复洗涤，最后用水洗直至不含氯离子。

氯离子的定性鉴别方法：取1mL上述上清液(洗涤液)于5mL试管中，加入几滴0.01 mol/L硝酸银溶液，振荡，观察是否有浑浊产生，如果有浑浊说明还含有氯离子，继续用水洗涤，直至不含氯离子为止。将此活性人造沸石于水中冷藏保存备用。使用时，倒入适量于铺有滤纸的漏斗中，沥干水后称取约8.0g倒入充满水的层析柱中。

(3)标准品盐酸硫胺素(C₁₂H₁₇CIN₄OS·HCl)，CAS: 67-03-8，纯度≥99.0%。

(4)标准溶液配制维生素B₁标准储备液(100ug/mL)：准确称取经氯化钙或者五氧化二磷干燥24h的盐酸硫胺素112.1mg(精确至0.1 mg)，相当于硫胺素为100 mg，用0.01 mol/L盐酸溶液溶解，并稀释至1000mL，摇匀。于0～4℃冰箱避光保存，保存期为3个月。

维生素B₁标准中间液(10.0ug/mL)：将标准储备液用0.01mol/L盐酸溶液稀释10倍，摇匀，在冰箱中避光保存。

维生素B₁标准使用液(0.100ug/mL)：准确移取维生素B₁标准中间液1.00mL，用水稀释、定容至100mL，摇匀。临用前配制。

(5)设备荧光分光光度计，离心机：转速≥4000r/min, pH计：精度0.01，电热恒温箱，盐基交换管或层析柱(60mL, 300mm×10mm内径)，天平：感量为0.01g和0.01mg。

3．检测步骤

(1)试样预处理用匀浆机将样品均质成匀浆，于冰箱中冷冻保存，用时将其解冻混匀。干燥试样取不少于150g，将其全部充分粉碎备用。

(2)提取准确称取适量试样(估计其硫胺素含量约为10～30ug，一般称取2～10g试样)，置于100 mL锥形瓶中，加入50mL 0.1 mol/L盐酸溶液，使得样品分散开，将样品放入恒温箱中于121℃水解30min，结束后，凉至室温后去除。用2mol/L乙酸钠溶液调pH为4.0～5.0或者用0.4g/L溴甲酚绿溶液为指示剂，滴定至溶液由黄色转变为蓝绿色。

酶解：于水解液中加入2mL混合酶液，于45～50℃恒温箱中保温过夜(16h)。待溶液凉至室温后，转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度：混匀、过滤，即得提取液。

(3)净化装柱：根据待测样品的数量，取适量处理好的活性入造沸石，经滤纸过滤后，放在烧杯中：用少许脱脂棉铺于盐基交换管柱(或层析柱)的底部，加水将棉纤维中的气泡排出，关闭柱塞，加入约20 mL水，再加入约8.0g(以湿重计，相当于干重1.0～1.2g)经预先处理的活性入造沸石，要求保持盐基交换管中液面始终高过活性入造沸石。活性入造沸石柱床的高度对维生素B1测定结果有影响，高度不低于45 mm。

样品提取液的净化：准确加入20mL上述提取液于上述盐基交换管柱(或层析柱)中，使通过活性入造沸石的硫胺素总量约为2～5 ug，流速约为1滴/s。加入10mL近沸腾的热水冲洗盐基交换柱，流速约为1滴/s，弃去淋洗液，如此重复三次。于交换管下放置25 mL刻度试管用于收集洗脱液，分两次加入20 mL温度约为90℃的酸性氯化钾溶液，每次10mL,流速为1滴/s。待洗脱液凉至室温后，用250g/L酸性氯化钾定容，摇匀，即为试样净化液。标准溶液的处理：重复上述操作，取20mL维生素B₁标准使用液(0.1ug/mL)代替试样提取液，同上用盐基交换管(或层析柱)净化，即得到标准净化液。

(4)氧化将5mL试样净化液分别加入A、B两支已标记的50mL离心管中. 在避光条件下将3mL 150g/L氢氧化钠溶液加入离心管A，将3mL碱性铁氰化钾溶液加入离心管B,涡旋15s；然后各加入10mL正丁醇，将A、B管同时涡旋90s。静置分层后吸取上层有机相于另一套离心管中，加入2～3g无水硫酸钠，涡旋20s，使溶液充分脱水，待测定。

用标准的净化液代替试样净化液重复上述的操作。

(5)荧光强度的测定测定条件：激发波长365nm；发射波长435 nm；激发波狭缝5nm；

①试样空白荧光强度(试液反应瓶A);

②标准空白荧光强度(标准反应瓶A);

③试样荧光强度(试样反应瓶B)；

④标准荧光强度(标准反应瓶B)。

4．结果计算

式中X—样品中维生素B₁(硫胺素计)含量，mg/100g；

U—试样荧光强度；

U_b—试样空白荧光强度；

S—标准荧光强度；

S_b—标准空白强度；

ρ₁—硫胺素标准使用液浓度，ug/mL ;

V—用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL;

V₁—试样水解后定容之体积，mL;

V₂—试样用于净化的提取液体积，mL ;

ρ₂—硫胺素标准使用液浓度，ug/mL ;

m—试样质量，g；
—样品含量由ug/g换算成mg/100g 系数。

5．说明

(1)本法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响噻嘧色素荧光物质的样品。

(2)检出限为0. 04mg/100g，定量限为0. 12mg/l00g。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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