黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AF)是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物。黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出20多种，主要是黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂以及由黄曲霉毒素B₁和黄曲霉毒素B₂在体内经过羟化而衍生成的代谢产物黄曲霉毒素M₁、黄曲霉毒素M₂等。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃香豆素衍生物，在紫外光下，黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂发蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂ 发黄绿色荧光。黄曲霉毒素耐热，可溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水、石油醚、己烷和乙醚。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在pH 9～10的强碱性溶液中迅速分解。黄曲霉毒素B₁的分解温度为268℃，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。

由于黄曲霉毒素是一类毒性极强的剧毒物质，1993年被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，表现为肝细胞变性、坏死，最终导致器官严重损伤。

黄曲霉的最适产毒温度为25～32℃。我国产生黄曲霉毒素的产毒菌株主要分布在华中、华南和华东地区，产毒量也较高，常常存在于动植物性食品，各种坚果，粮油及其制品，如花生、胡桃、杏仁、大豆、稻谷、玉米、调味品、乳制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。我国规定了食品中黄曲霉毒素的允许限量花生、玉米为20 ug/ kg，乳及乳制品为0.5ug/kg，豆类、发酵食品为5 ug/g。

黄曲霉毒素的检测方法包括：薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、微柱筛选法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫亲和柱-荧光分光光度法、免疫亲和柱-HPLC法等。本实验主要介绍免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和柱净化-高效液相色谱法。

(一)免疫亲和柱-荧光分光光度法

1．检测原理

样品中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇一水提取，提取液经过过滤、稀释后，用免疫亲和柱分离净化，以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度，然后用荧光分光光度计进行定量测定。

2．主要试剂及仪器

真菌毒素专用荧光分析仪；黄曲霉毒素免疫亲和柱；0.03％的溴溶液；荧光分析仪校准溶液：3.4g二水硫酸奎宁，用0.05mol/L稀硫酸稀释至100mL。

氯化钠、甲醇(色谱级)、重蒸馏水、1.5um的玻璃纤维滤纸。

3．检测步骤

(1)标定荧光计配制0.003%溴衍生溶液(每天配制)：取5 mL 0.03％的溴溶液，加入45 mL的蒸馏水；甲醇：水(60 : 40，体积比)溶液；试剂对照试验(1mL甲醇+ 1mL 0.003%溴衍生液置于测试管中)，荧光计读数应为0;纯水对照实验(2mL纯水置于测试管中)，荧光计读数应为。

(2)毒素提取称取25 g样品，5g氯化钠，置于搅拌杯中，加入125 mL甲醇：水(60 : 40)溶液，盖上杯盖高速搅拌1 min后将提取物倒入折叠式滤纸上，滤液收集于千净的容器中。吸取20mL滤液，置于干净的容器中，用20 mL蒸馏水稀释，混匀。经过玻璃纤维滤纸过滤，滤液收集于玻璃注射管中。

(3)亲和柱操作取10mL滤液以1～2滴/s的流速全部通过Af-LaTest-P亲和柱，直至空气进入亲和柱，取10mL蒸馏水以2滴/s的流速通过亲和柱；取10mL蒸馏水以2滴/s的流速再次通过亲和柱，直至空气进入到亲和柱中。用1.0mL色谱级的甲醇以1～2滴/s的流速淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液(1mL)收集于玻璃测试管中。取1.0mL 0.003%溴衍生溶液加到测试管的淋洗液中，混匀。

(4)荧光光度计测定将制备好样液的测试管置于已标定好的荧光计中。60s后读数，测定结果为黄曲霉毒素B₁+黄曲霉毒素B₂＋黄曲霉毒素G₁＋黄曲霉毒素G₂的总量。

4．注意事项

(1)溴衍生溶液需当天配制，当天使用，不可重复使用。

(2)严格操作样品处理过程。

(3)操作人员需戴口罩和手套进行样品处理，避免有毒有机溶剂毒害。

(4)一般来说，每个检测项目均应做平行试验和空白试验。平行试验是采用相同的分析步骤，空白试验是除不加试样外，其他步骤同测定平行试验。

(二)免疫亲和柱净化一高效液相色谱法

1.检测原理

样品经过甲醇-水提取后，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析柱层析净化，经高效液相色谱仪分离，荧光检测器柱后光化学衍生增强后，综合测定黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂等含量。

2．主要试剂及仪器

(1)试剂

①甲醇、苯及乙腈为色谱纯，其试剂为分析纯。甲醇＋水(8+2)：取80mL甲酵加20mL水，混合均匀。甲醇＋水(45+55)：取45 mL甲醇加55 mL水，混合均匀。苯＋乙腈(98+2)：取2mL乙腈加98 mL苯，混合均匀。

②黄曲霉毒素标准储备溶液：用苯＋乙腈(98+2)溶液分别配制0.100mg/mL黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂标准储备液，保存于4℃备用，可使用1年。

③黄曲霉毒素混合标准溶液：准确移取适量的黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂标准储备溶，50℃下，氮气吹干仪吹干，用适量的甲醇＋水(45+55)溶液定容为混合标准工作液，黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂各分别为0、1、5、10、50ng/mL。

④PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990 mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.0，最后用纯水稀释至1000 mL。

(2)仪器与设备高速均质器(18000～22000r/min )或振荡器，黄曲霉毒素免疫亲和柱(柱容量≥300ng)，玻璃纤维滤纸(直径11cm，孔径1.5um) ,氮吹仪，光化学衍生系统，高效液相色谱仪(带荧光检测器)。

3．检测步骤

(1)提取取样品(粒度小于1mm) 50.0g于250 mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及准确加入100.0 mL甲醇＋水(8+2)溶液，以均质器高速搅拌提取2min，或振荡器振荡30min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液并加入40.0mL PBS缓冲溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清，备用。

(2)净化将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃定量管下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃定量管中，将空气压力泵与玻璃定量管连接，调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，待溶液全部流出后，以10.0mL纯水清洗柱子2次，弃去全部流出液，准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速不超过1.0mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，加纯水定容为2.0mL，供色谱检测用。

(3)测定

①色谱条件：色谱柱：c₁₈柱(150mm×4.6 mm id)，流动相：甲醇＋水(45+55)溶液，流速：0.8mumin，检测波长：激发波长360nm、发射波长440nm。

②光化学衍系统：柱温：30℃，进样量：20 uL

③色谱测定：分别取相同体积样液和标准工作溶液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值(峰高或峰而积)。经过与黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂标准溶液谱图比较响应值，得到试样中黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂的浓度ρ(ug/L)。

(4)结果计算样品中黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂含量，按下式计算：

式中A_i—样品溶液中黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂各组分的峰面积值；

V_i—样品的总稀释体积，mL ;

P_i—黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂各标准溶液浓度，ng/mL；

V_st—标准溶液的进样体积，uL;

A_st—黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂各标准溶液峰面积平均值；

m—试样质量，g。

4．注意事项

黄曲霉毒素是高致癌性物质，应十分小心操作，使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液用5％浓度次氯酸钠溶液浸泡过夜。沾有黄曲霉毒素的废弃物按有毒物处理。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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