赭曲霉毒素(Ochratoxins)是储色曲霉属和青霉属产生的代谢产物，包括A,B,C,D等多种分子结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(OchratoxinA，简称OA)毒性最强，是自然界中主要天然污染物. 玉米、谷物和大豆中均可分离到赭曲霉毒素。但饲料中的 OA污染水平高于食品。由于OA能通过饲料进入动物组织，人类通过食用动物源食品而摄入OA。该毒素主要表现为肾脏毒性，可严重损害肾脏及肝脏，对实验动物具有致畸和致癌作用。

OA是无色结晶化合物，溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。其乙醇溶液可置冰箱中保存一年以上，但在谷物中或接触紫外线，几天就会降解。

产生OA的霉菌，主要是青霉属和曲霉属，如赭曲霉(A.ochraceus)、淡褐色曲霉属(A.alutaceus)、硫色曲霉(A.Sulphureus)、菌核曲霉(A. sclerotium)、蜂蜜曲霉(A. rnelleus)、洋葱曲霉(A.alliaceus)、孔曲霉(A.ostianus)及圆弧青霉(P.cyclopiuan)、变幻青霉(P.variabile)等：曲霉属和青霉属产毒条件是：曲霉属的最重宜水分活度为0.99，产毒温度为12～37℃，青霉属的最适宜水分活度为0.95，产毒温度为4～31℃。容易感染赭曲霉毒素的商品包括大豆、绿豆、咖啡豆、玉米、小麦、大麦、燕麦、啤酒、葡萄汁、干果、调味品、草本植物等。

OA的检测方法包括：薄层色谱法、HPLC、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱-荧光法、免疫亲和柱-HPLC法等。本实验主要介绍免疫亲和柱-HPLC法。该方法可适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中OA含量的测定。

(一)检测原理

用提取液粗提样品中的OA，然后经免疫亲和柱收集浓缩、甲醇洗脱液洗脱并定容后，用荧光检测器的高效液相色谱测定，外标法定量。

(二)试剂及仪器

1．试剂

①甲醇、乙腈及冰乙酸等为色谱纯，其他所用试剂均为分析纯。

②提取液1：甲醇+水(80+20)。提取液2：称取150g氯化钠、20g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。冲洗液：称取25g氯化钠、5g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1mL吐温-20，用水稀释至1L。OA标准品：纯度＞98%。

③OA标准储备液：准确称取一定量的OA标准品，用甲醇+乙腈(1+1)溶解，配成0.1mg/mL的标准储备液，在-20℃保存，可使用3个月。

④ OA标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的OA储备液，用流动相稀释，分别配成相当于1、5、 10、20、50ng/mL的标准工作液，4℃保存，可使用7d。

2．仪器与设备

OA免疫亲和柱，玻璃纤维滤纸(直径11cm、孔径1.5 um、无荧光特性)，高效液相色谱仪(配有荧光检测器)，均质器(转速大于10000r/min)，高速万能粉碎机(转速10000r/min)、空气压力泵、超声波发生器等。

(三)检测步骤

1．样品的制备与提取

(1)粮食和粮食制品将样品研磨，硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛(56mm)，不要磨成粉末。取20.00g左右磨碎的试样于100 mL容量瓶中，加入5.0g氯化钠，用提取液1定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至
滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。

(2)酒类取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20.00g左右，置于25mL容量瓶中，加提取液2定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。

(3)酱油、醋、酱及酱制品称取25.00g左右混匀的试样，用提取液1定容至50.0mL，超声提取5 min。定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液C于干净的容器中。

2．样品的净化

(1)粮食和粮食制品将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液A 10.0mL,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10 mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。

(2)酒类将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液B 10.0mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL冲洗液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。

(3)酱油、醋、酱及酱制品将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液C 10.0mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10 mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。

3．洗脱

准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s ，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，用甲醇定容至1.0mL，供HPLC测定。

4．高效液相色谱参考条件

①色谱柱：C₁₈ 柱，5um, 150mm×4.6mm或相当者；柱温：35℃

②流动相：乙腈＋水＋冰乙酸(99+99+2)；流速：0.9 mL/min。

③进样量：10～100 uL；检测波长：激发波长333nm，发射波长477 nm。

5．定量测定

以OA标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中OA的响应值均应在仪器检测线性范围内。

6．结果计算

试样中OA的含量按下式计算：

式中X—试样中赭曲霉毒素A的含量，ug/kg;

P₁—试样溶液中赭曲霉毒素A的浓度，ng/mL;

P₀—空白试样溶液中赭曲霉毒素A的浓度，ng/mL ;

V—甲醇洗脱液体积，mL;

m—试样的质量，g;

f—稀释倍数。

相关链接：食品中黄曲霉毒素

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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