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伏马毒素B

发布时间:2018-09-30 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1912

伏马毒素B(Fumonisin, FB)是1989年发现的一种新型毒素,是串珠镰刀菌在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的一类霉菌毒素。目前已知有7种衍生物,有伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3等,其中60%以上是伏马毒素B1,其毒性也最强。伏马毒素B1为白色针状结晶,易溶于水。研究证实,伏马毒素可导致马产生白脑软化症(ELEM),神经性中毒而呈现意识障碍、失明和运动失调,甚至造成死亡;并被怀疑可诱发人类的食道癌等疾病,从而对畜牧业及人类的健康构成威胁。

玉米最易感染串珠镰刀菌,尤其在贮藏过程中水分在18%~23%时,最适宜串珠镰刀菌的生长和繁殖,导致玉米伏马毒素含量的增加,并由此产生人畜安全隐患。另据资料表明,在大米、面条、调味品、高粱、啤酒中也有较低浓度的伏马毒素存在。美国规定伏马毒素的限量为2mg/kg。

伏马毒素残留主要有免疫亲和柱-荧光法、免疫亲和柱-HPLC法、毛细管电泳法、液相色诏沙质谱法及伏马毒素试剂盒法等方法检测。2017年3月起实施的GB 5009.240-2016《食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定检测标准》规定伏马毒素检测主要是为伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3三种;同时介绍了免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法作为第一法,高效液相色谱一串联质谱联用法作为第二法,免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱法为第三法。其中第三法特别适用于玉米及其制品中伏马毒素的测定。本试验主要介绍第一法,同时测定相关食品中伏马毒素B1、伏马毒素B2和伏马毒素B3残留量。

(一)检测原理

样品中的伏马毒素可用一定比例的乙腈-水溶液提取,经稀释后过免疫亲和柱净化,去除脂肪蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质,然后经高效液相色谱分离后,邻苯二甲醛柱后衍生,荧光检测,外标法定量。

(二)试剂及仪器

1.试剂

甲醇乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

2.溶液配制

(1)磷酸盐缓冲液(PBS)称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用980mL水溶解,用盐酸调整pH至7.4,用水稀释至1000mL,混合均匀。

(2)吐温-20/PBS溶液(0.1%)吸取1mL吐温-20,加入PBS稀释至1000mL,混合均匀。

(3)硼砂溶液(0.05 mol/L , pH 10.5)称取硼砂19.1g,溶于980mL水中,用氢氧化钠溶液调pH至10.5,用水稀释至1000mL,混合均匀。

(4)衍生溶液称取2.0g邻苯二甲醛,溶于20 mL甲醇中,用硼砂溶液(0.05 mol/L,pH10.5)稀释至500mL,加入2-琉基乙醇500uL ,混匀,装入棕色瓶中,现用现配。

3.标准品

(1)伏马毒素B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)和伏马毒素B3(FB3),纯度=95%,或有证标准溶液。

(2)标准溶液配制

①标准储备溶液(0.1mg/mL):分别准确称取FB1、FB2、FB3各0.01g(精确至0.0001g)至小烧杯中,用乙腈-水溶液(50+50)溶解,并转移至100 mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光-20℃保存。有效期6个月。

②混合标准溶液:准确吸取FB1标准储备液1mL, FB2和FB3标准储备液各0.5mL至同-10 mL容量瓶中,加乙腈-水溶液(50+50)稀释至刻度,得到FB1浓度为10ug/mL、FB2和FB3浓度为5ug/mL的混合标准溶液。再稀释10倍,得到FB1浓度为1 ug/mL、FB2和FB3浓度为0.5 ug/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期6个月。

③混合标准工作溶液:准确吸取混合标准溶液,用乙腈-水溶液(50+50)稀释,配制成FB1浓度依次为20、80、160、 240、320、400ng/mL,FB2和FB3浓度依次为10、40、80、120、160、200ng/mL的系列混合标准工作溶液。

4.仪器与设备

高效液相色谱仪,带荧光检测器;柱后衍生系统;离心机(转速≥4000r/min );免疫亲和柱(柱容量≥5000ng, FB1柱回收率≥80%)。

(三)检测步骤

l.样品制备

将固体样品按四分法缩分至1kg,全部用谷物粉碎机磨碎并磨细至粒度小于1 mm,混匀分成2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。玉米油样品直接取2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。

2.试样提取

准确称取固体样品5g(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入20mL乙腈-水溶液(50+50),涡旋或振荡提取20min,取出后,在4000r/min下离心5min,将上清液转移至另一离心管中。玉米油样品操作同固体样品,提取液在下层。

3.试样净化

取2 mL提取液,加入47mL吐温-20/PBS溶液,混合均匀后过免疫亲和柱,流速控制在1~3mL/min,用10mLPBS缓冲液淋洗免疫亲和柱,分别用1mL甲醇-乙酸溶液(98+2)洗脱免疫亲和柱三次,收集洗脱液,55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(20+80)溶解残渣。涡旋30s,过0.45um微孔滤膜后,收集于进样瓶中,待测。

4.仪器参考条件

色谱柱:C18 色谱柱:250mm×4.6mm, 5um,或相当者;检测波长:激发波长335nm;发射波长440nm;流动相:A:甲酸水溶液(0.1%), B:甲醇;梯度洗脱(洗脱程序见表4-7),流动相流速:0.8mL/min;衍生液流速:0.4mL/min;柱温:40℃,反应器温度:40℃;进样量:50uL。

表4-7 流动相洗脱程序

5. 试样测定

分别取50.0uL系列伏马毒素混合标准工作溶液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪;待仪器条件稳定后,以目标物质的浓度为横坐标(x轴),目标物质的峰面积为纵坐标(y轴),对各个数据点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式(4-12)计算:

y=ax+b    (4-12)

式中y—目标物质的峰面积比;

a—回归曲线的斜率;

x—目标物质的浓度;

b—回归曲线的截距。

6.空白试验

不称取样品,同样进行提取和净化做空白试验,以确认不含有干扰待测组分的物质。

7.结果计算

待测样品中FB1、FB2、FB3的含量按式(4-13)计算:

X=p×V×fm     (4-13)

式中X—待测样品中FB1、FB2、FB3的含量,ug/kg;

p—待测物进样液中FB1、FB2、FB3的浓度,ng/mL ;

V—定容体积,mL;

f—试液稀释倍数;

m—样品的称样量,g。

(四)注意事项

1.对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验。柱容量及柱回收率验证方法如下:

(1)柱容量验证方法在30mL的吐温-20/PBS溶液(0.1%)中加入15ug FB1标准储备溶液,充分混匀。分别取同一批次3根免疫亲和柱,每根柱的上样量为10mL (5ugFB1)。经上样、淋洗、洗脱,收集洗脱液,用氮气吹至约1mL,用乙腈-水溶液(20+80)定容至10mL,用液相色谱仪分离测定FB1的含量。

结果判定:结果FB1≥4.5 ug,为柱容量满意。

(2)柱回收率验证方法取2mL空白样品提取液,加入47 mL吐温-20/PBS溶液(0.1%),加入15 ug FB1标准储备溶液,用吐温-20/PBS溶液(0.1%)定容至50mL,充分混匀。分别取同一批次3根免疫亲和柱,每根柱的上样量为10mL (3ug FB1)。经上样、淋洗、洗脱,收集洗脱液,用氮气吹干至1mL,用乙腈-水溶液(20+80)定容至10mL,用液相色谱仪分离测定FB1的含量。

结果判定:结果FB1≥2.4Kg,则回收率≥80%,为柱回收率满意。

2.该方法定量测定伏马毒素时,当称样量为5g时,FB1、FB2、FB3,的检出限分别为17、8、8ug/kg,定量限分别为50、25、25 ug/kg。

文章来源:《食品质量与安全检测技术》

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