脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)，又称为呕吐毒素(vomintoxin)，属单端孢霉烯族化合物。该毒素是镰刀菌霉(F. graminearum和F. culmorum)的二级代谢产物。它广泛存在于玉米、小麦、水稻、豆饼等粮食及饲料中。造成DON污染的主要因素受贮存时温度、湿度的影响，高湿气、低温条件下，霉菌在谷物中缓慢生长，产生镰刀菌毒素。DON一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度，在黑麦、高粱、大米中的浓度较低。DON常常与其他真菌毒素同时存在，从谷物和饲料中分离出来的DON的最高浓度可达92mg/kg。DON含量超过1mg/kg，会对人及动物健康产生安全隐患。DON的中毒症状表现为：厌食、呕吐、消化道炎症、白血球下降、运动失调、内脏出血、中枢神经系统病变。美国食品及药物管理局(FDA)规定，食品中DON的安全标准为1mg/kg，这也是我国规定的DON限量标准。

在单端抱霉烯族化合物中，DON由于在分子结构上存在着三个羟基，为复合抗原(毒素与载体蛋白的复合物)的制备带来一定的困难。1988年，Casale等人用丁基硼酸将DON分子结构中7和15位上的两个羟基先期封闭起来，通过3位上的羟基转变成琥珀酸酐衍生物，继而实现与载体蛋白的结合。运用该方法，已制备出抗DON的单克隆抗体，并建立了小麦中测定DON的间接酶联免疫吸附测定法。根据该方法生产的试剂盒，可检测样品中百万分之一的DON残留。本实验介绍免疫亲和层析净化高效液相色谱法的测定技术。

(一)检测原理

用提取液提取样品中的DON，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱分离、紫外检测器测定，外标法定量。本方法的粮食及粮食制品检出限为0.5 mg/kg，酱、酒、醋等检出限为0.1mg/kg。

(二)试剂和仪器

1．试剂

①甲醇和乙腈为色谱纯，其它所用试剂均为分析纯。聚乙二醇(相对分子质量8000)。

(2)PBS清洗缓冲液：称取8.0g氯化铀、1.2g磷酸氢二钠、0.2 g磷酸二氢钾、0.02g氯化钾，用990mL水将上述试剂溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.0，再用水稀释至1.0L。

③DON标准储备液：准确称取一定量的DON标准品(纯度≥98%)；用甲醇溶解，配成0.1 mg/mL的标准储备液，在-20℃保存，可使用3个月。

④DON标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的DON标准储备液，用流动相稀释，分别配成相当于0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0ug/mL的标准工作液。4℃保存，可使用7d。

2．仪器与设备

脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱，玻璃纤维滤纸(直径1cm，孔径15um)，均质器(转速大于10000r/min)，高速万能粉碎机(转速10000r/min )，空气压力泵，高效液相色谱仪(配紫外检测器或二极管阵列检测器)。

(三)检测步骤

1.样品制备与提取

(1)粮食和粮食制品将样品研磨(硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过1.0mm孔径的试验筛)，取25.00g左右磨碎的样品于100mL容量瓶中，加入5.0g聚乙二醇，用水定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌2min。定量滤纸过滤后，以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。

(2)酒类取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20.00g左右，加入1.0g聚乙二醇，用水定容至25. OmL，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。

(3)酱油、醋、酱及酱制品取样品25.00g左右，加入5.0g聚乙二醇，用水定容至100.0mL，高速搅拌提取2min，定量滤纸过滤后，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液C于干净的容器中。

2．样品净化

将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取滤液A或B或C 2.0 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使滤液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5 mL PBS清洗缓冲液和5mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s ，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。

3．洗脱

准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s ，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，HPLC测定。

4．测定

(1)色谱参考条件色谱柱：C₁₈柱，5um, 150mm×4.6mm，流动相：甲醇＋水(20+80)，流速：0.8 mL/min，柱温：35℃，进样量：50 uL，检测波长：218nm。

(2)定量测定以DON标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中DON的响应值均应在仪器检测线性范围内。

5．结果计算

样品中DON的含量按下式计算：

式中X—样品中DON的含量，mg/kg;

P₁—样品溶液中DON的浓度，ug/mL;

P₀—空白样品溶液中DON的浓度，ug/mL;

f—甲醇洗脱液体积，mL ;

m—试样的质量，g;

f—稀释倍数。

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文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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