杂色曲霉毒素(sterigmatocystin，简称ST)主要是由曲霉属的某些菌种，如杂色曲霉、构巢曲霉、皱曲霉、赤曲霉、焦曲霉、爪曲霉、四脊曲霉、毛曲霉以及黄曲霉、寄生曲霉等产生的有毒代谢产物，1954年首先从杂色曲霉的培养物中分离出一种淡黄色针状结晶，并命名为杂色曲霉素，结构上与黄曲霉毒素B₁非常相似，是黄曲霉毒素生物合成过程的中间体。ST在化学结构上，具有双氢呋喃苯并呋喃系统。ST的分子式C₁₈H₁₂O₆，相对分子质量324.06，熔点246 ℃。可溶于大多数非极性溶剂，不溶于水，难溶于极性溶剂、氢氧化钠及碳酸钠水溶液。氯仿对ST的溶解度最大，可作为萃取ST的首选溶剂。在紫外光下具有暗砖红色荧光。

杂色曲霉在自然界分布很广，存在于乳制品、谷类和饲料中。ST主要由杂色曲霉群和构巢曲霉群的某些菌种产生。ST是一种毒性很强的肝及肾脏毒素，对实验动物均显示了强致癌性，可诱发肝癌和胃癌。杂色曲霉毒素中毒，国内又称“黄肝病”或“黄染病”。在肝癌高发区所食用的食物中，杂色曲霉素污染较为严重，可导致人类食物中毒和产生毒性损伤效应。

据报道，ST的检测方法有气相色谱法(GC)、气质联用法(GC-MS)和高效液相色谱法(HPLC)等，但现行的植物性食品中杂色曲霉素的测定还是薄层层析法(TLC)(GB/T 5009. 25-2003 )。本实验主要介绍薄层色谱法测定ST。

(一)检测原理

样品中的ST经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质。根据其在薄层上显示的荧光最低检出量，确定样品中ST的含量。

(二)试剂及仪器

硅胶薄板、展开槽、紫外灯。

乙腈,5%氯化钠水溶液(9：1)、正己烷、氯仿、无水硫酸钠。

ST标准溶液的配制：准确称取ST结晶10mg，用苯定容至100mL棕色容量瓶中。分别吸取1mL和0.5 mL于2个10 mL棕色容量瓶中，加苯稀释至刻度，分别配成100、10、0.5ug/ mL标准液。避光，4℃冰箱中保存。

(三)检测步骤

1．粗毒素的提取

取50g粉碎过20目筛的样品，加250mL乙腈：5％氯化钠水(9：1)溶液，振荡30min,过滤；残渣加入150mL乙腈:5%氯化钠水溶液，振荡过滤；将2次滤液加200mL正己烷，振摇2min，静止分层，弃去正己烷层，将乙腈-水层加5%氯化钠水溶液100 mL和氯仿200 mL，振摇2min，静止分层，乙腈-水层加100 mL氯仿，振摇分层后，弃去乙腈-水层，收集2次氯仿层加无水硫酸钠振摇、过滤、浓缩至干，得到粗毒素。

2.薄层层析

(1)点样上述挥干物用苯或氯仿溶解后，配成苯或氯仿含量为5 mg/mL粗毒素的溶液，供薄层层析用。硅胶薄层板(10cm×10cm)2块，临用前105℃活化2h;在距下端0.3～1cm基线上加样，每板加2个样点，第一点距左边缘0.8～1cm处滴加标准液(0.4ug/mL)10uL，在距左边缘4cm处滴加样液8uL，然后在第二块板的样点上加滴标准液10uL。 在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。

(2)展开用双向薄层展开。

①横向展开：在展开槽内加入乙醚：正己烷：苯：氯仿：甲酸(20:60:10:10:4)溶液15mL，将上述点好的薄层板靠近左边标准点的一边从槽的斜对角位置放人展开，刚展至板端时，取出挥干。

②纵向展开：将近干的薄层板靠近标准点与样点的一边以苯：甲醇：乙酸溶液(90:8:2) 15mL展开至刚到板端时，取出挥干。

(3)显荧光于薄层板上喷20％三氯化铝(AIC1₃·6H₂O)乙醇溶液，迅速将板放置于80℃加热10min，取出后立即在365 nm波长的紫外光下观察，待薄层板冷却后再喷第2次(不需要加热)，可直接观察结果。

(4)确证实验第一次展开后，在样品的类似杂色曲霉素的样点上，以及杂色曲霉素的标准样点上，各滴加5uL无水三氟乙酸，用苯：甲醇(9:1)横向展开。用20% AICI₃乙醇溶液喷雾，紫外线下观察，有无黄色荧光点，三氟乙酸与杂色曲霉素的反应物R_f值为0.3左右。

(5)样品的定量方法按上法测得ST的Rf值约为0.6。如果在第一块薄层板上，ST标准品与样品中的ST荧光强弱相当，则样品中的ST含量为12.5ng/g。若样品中的ST的荧光比标准荧光强，则可减少样液的点加量或稀释后点样，直到样品的ST荧光点强度与ST标准一致为止，按下式计算样品中ST的含量。

ST含量＝最低检出量×V×D/C×1000/m(ug/kg)         (4-15)

式中V—与最低检出量荧光强度相当的样液点加体积，mL ;

D—样液总稀释倍数；

C—ST标准品浓度，ug/mL ;

m—样品质量，kg,

本方法ST的最低检出量为0.005 ug。当降低到0.002 ug尚可看到，但亮黄色发暗。

(四)注意事项

(1)点样后一定等薄层板干燥后再开始层析。

(2)取样时各样品要有各自固定的微量吸管，以免样品之间互相污染。

(3)点样直径不要超过5mm，并用吹风机边吹边点。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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