多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAH)是一类广泛存在于环境中的有机化合物，有致癌作用的多环芳烃约有20种，其中最具有代表性的致癌物为3, 4-苯并芘(五环化合物)，其次为1,2-苯并芘(四环化合物)和3,4,9,10-苯并芘(六环化合物)。多环芳烃产生的原因很多，当煤炭、石油和天然气等燃烧不完全时，便形成多环芳烃化合物。细菌、原生动物、淡水藻类和高等植物本身也能合成多环芳烃。

多环芳烃的测定方法有薄层层析法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法(GB/T23213-2008)。本试验介绍用甲醇-水作流动相，采用梯度洗脱和程序切换荧光检测波长的高效液相色谱法。

(一)测定原理

多环芳烃类化合物分子中具有刚性的平面结构和多个共轭双键，受紫外光照射会发出荧光，荧光的强度与样液中多环芳烃的浓度成正比。利用甲醇一水作流动相进行反向高效液相色谱梯度洗脱，采用程序切换波长的荧光检测器检测分离开的多环芳烃，达到快速、准确测定食品中多环芳烃的目的。

(二)试剂和仪器

1．试剂

(1) PAH标准储备液准确称取一定量PAH，用环己烷或苯溶解定容。其各自的浓度为：萘(Na)1400 ug/mL，菲(Phe)1560 ug/mL ,蒽(Ant)1080 ug/mL ,荧蒽(Flt)318 ug/mL,芘(Py) 1140ug/mL，屈(Chy)1080ug/mL，苯并(a)蒽(BaA) 1260ug/mL，苯并(b)荧蒽(BbF)176ug/mL，苯并(k)荧蒽(BkF) 1160ug/mL，苯并[a]芘(BaP)1400ug/mL，二苯并[a,h]蒽(dBahA) 1200ug/mL，苯并[g,h,I]苝(BghIP) 190ug/mL ,茚并[1,2,3-cd]芘(IndenoP)280 ug/mL。

(2) PAH标准应用液根据待测样品中多环芳烃的含量，将PAH标准储备液用甲醇稀释100～1000倍，配成浓度为0.1～10ug/mL PAH的混合标液。

(3)甲醇为分析纯，重蒸后经0.3 um滤膜抽滤。

2．仪器与设备

(1)高效液相色谱仪配有荧光检测器色谱柱，Phenomenex (USA); C₁₈柱(ODS) ,5 um, 250mm×4.6 mm , i.d；液相色谱微量进样器(25uL, 100uL)。

(2)玻璃色谱柱(Sephadex LH-20目)，20mm×250mm; K-D浓缩仪；玻璃砂芯漏斗：40～60目。

(三)测定步骤

1．样品制备与处理

(1)样品处理取熏烤肉样用热水洗去表面黏附的杂质，晾干后去骨头，将可食部分粉碎后备用。

(2)样品的提取、净化与富集

①提取：准确称取样品100g于500mL圆底烧瓶中，加入2 mol/L氢氧化钾的甲醇-水(9+1)溶液200mL，在沸水浴中回流加热3h。

②净化：将皂化液移入500mL分液漏斗中，用100mL环己烷分两次洗涤回流瓶，洗液并入分液漏斗中，振摇1 min，静置分层，下层水溶液放至另一500mL分液漏斗中. 用100mL环己烷重复提取2次，合并环己烷，先用200mL甲醇＋水(1＋1提取1min，弃去甲醇-水层，再用200mL水提2次，弃去水层。在旋转蒸发仪上浓缩环己烷液至40mL，移入125 mL分液漏斗中，以少量环己烷洗蒸发瓶2次，合并环己烷。用硫酸(6+4) 50mL净化提取2次，每次摇1 min，弃去硫酸液，用水洗环己烷层至中性。将环己烷层通过装有6g硅胶和少量无水硫酸钠的40～60目玻璃砂芯漏斗过滤，另用50 mL环己烷洗涤漏斗，合并环己烷，在旋转蒸发仪上浓缩环己烷至2mL。

③富集：将环己烷浓缩液转移至10g Sephadex LH-20柱内，用异丙醇洗脱，弃去前50mL，收集50-150mL馏分段洗脱液，在K-D浓缩仪(70℃)上蒸发至0.2 mL左右时，用甲醇定容至1.0mL。置冰箱中备用。

2. PAH标准曲线的绘制

分别吸取0.10、0.50、1.00、3.00和5.00uL PAH混合标准液进行色谱分析，以各PAH含量(ng)为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，共13条。

色谱分析条件：柱温25℃，流速1 mL/min；梯度洗脱程序：由73％甲醇开始，42 min线性升至92％甲酵；按表4-12进行程序波长切换。

表4-12 检测波长切换时间程序

3．样品测定

取待测样品液5～20uL按照测定PAH混合标准液的同样条件进行色谱分析，以保留时间定性，峰面积定量。根据样品峰面积，从各PAH标准曲线查得其含量。mx。再计算各种PAH的含量。

计算公式如下：

式中m_x—由峰面积查得的相应PAH含量，ug;

V—样品浓缩体积mL;

m—样品质量，g；

V₁—进样体积，mL;

(四)注意事项

(1)根据标准样品的出峰顺序调节波长切换的时间。

(2)用热水洗涤熏肉样品时，注意不要造成多环芳烃的损失。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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