(三)ELISA的材料与试剂

完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：

(1)己包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂)。

(2)酶标记的抗原或抗体(结合物)。

(3)酶的底物。

(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品和控制血清(定量测定中)。

(5)结合物及标本的稀释液。

(6)洗涤液。

(7)酶反应终止液。

1．免疫吸附剂

已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2～8℃)干燥的条件下一般可保存6个月。有些不完整的试剂盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。下文简述固相载体和包被过程。

(1)固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。

ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放人座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。

良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。

(2)包被的方式将抗原或抗体固定在固相载体表面的过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子质量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，所以更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。

(3)包被用抗原用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成分外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列入工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子质量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质，如牛血清白蛋白质(BSA)等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。

(4)包被用抗体包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质(即便是极微量的)，在抗血清中将出现杂抗体，必须除去(可用吸收法)后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和SepHadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性也较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。

(5)包被的条件包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH 7.2的磷酸盐缓冲液及pH 7～8的Tris-HCl缓冲液作为稀释液。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4～8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2h被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/mL～20ug/mL。

(6)封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05％～0.5％的牛血清白蛋白，也有用10％的小牛血清或1％明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度(5%)使用。高质量的速溶食用低脂乳粉即可直接当作封闭剂使用，但由于乳粉的成分复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。

2. 结合物

结合物即酶标记的抗体(或抗原)，是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活力，也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。结合物中酶与抗体(或抗原)之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(末结合的)酶或游离的抗体(或抗原)。此外，结合物尚要有良好的稳定性。

(1)酶用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活力部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。

(2)抗原和抗体制备结合物时所用的抗体一般为纯度较高的IgG，以免在与酶联结时受到其他杂蛋白的干扰。最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。

(3)结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。

①戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法有一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60％～70%)和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。

②过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按摩尔比例联结，其最佳比例为：酶/抗体＝(1～2)/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所用试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。

按以上方法制备的酶结合物一般都混有末结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活力测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开：用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较高。

结合物制得后，在用作ELIS A试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，得到最合适的测定条件和节省测定费用。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。

(4)结合物的保存酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冷冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的降低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液，临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4～8℃保存期可达6个月二由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠)，以防止细菌生长。

(5)结合物的稀释液用于稀释高浓度的结合物以配成工作液：为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1％牛血清白蛋白)，通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05％的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。

3.酶的底物

(1) HRP的底物HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H₂O₂,其反应式如下：

DH₂＋H₂O₂→D＋2H₂O

上式中，DH₂为供氧体，H₂O₂为受氢体。在ELISA中，DH₂一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(0-phenylenedia-mine,OPD)和四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine , TMB)。

OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm波长处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCl为水溶性。曾有报道OPD有致突变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配现用。在试剂盒中，OPD和H₂O₂一般分成两个组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H₂O₂的应用液，只需加入OPD后即可作为底物应用液。

TMB经HRP作用后其产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H₂O₂溶液混合即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCI或H₂SO₄终止后，TMB产物由蓝色变为黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405 nm。

(2) AP的底物AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405 nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。
AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)，可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。

4．稀释液

洗板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05％吐温20的磷酸缓冲盐水。

5.酶反应终止液

常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

6．阳性对照品和阴性对照品

阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。

7. 参考标准品

定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4～5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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