进一步采用HPLC—DAD—MS分析，对此5种有关物质的结构进行了初步的确证。

(1)色谱条件

色谱柱：Shimadzu VP—ODS(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇一0.5％醋酸水溶液(30：70)；流速：1.Oml／min；进样量：20μl；检测波长：250nm；柱温：30℃。
(2)质谱条件

质谱采用ESI离子化模式，正、负离子检测模式下进行检测；雾化气压力25psi；干燥气为氮气，流量9L／min，温度325℃；扫描方式：SCAN，扫描范围m／z：50-1000：MS／MS碰撞能量：2．5V(智能碰撞30％一200％)。

(3)结果

在所述色谱条件下，5种有关物质和葛根素均能得到很好的分离，采用DAD检测，可初步确认各有关物质的紫外吸收光谱与异黄酮类化合物的紫外特征吸收有一定的相似性。

质谱检测时，分别在正负离子模式下进样，一级质谱提供分子量信息，结果见表1。二级、三级质谱图可提供更多结构信息。对比正、负离子模式下的质谱图发现，在正离子模式的多级串联质谱中，葛根素及其有关物质的碎裂生成一系列较复杂的离子峰，除保留黄酮母环外还有糖苷键的存在，并非一次碎裂失去，在二级、三级谱中出现许多碎片离子峰。在负离子模式下的多级串联质谱中，各组分的碎裂较单一，碎片产生机理解析也简单，但不能提供更多的分子结构信息。将正负离子两种模式结合起来，可得到更多分子结构信息，既有利于结构解析，也有利于两种质谱模式互相验证。

据文献报道，葛根中含有3’一羟基葛根素、染料木苷及染料木素一8一葡萄糖苷三种分子量为432的同分异构体。

分析其各级质谱图，可初步确认有关物质A和有关物质C互为同分异构体。在负离子模式下，有关物质A和有关物质C都产生M一120的碎片离子，在正离子模式下，有关物质A和有关物质C主要产生一系列脱水峰和M—120离子。从文献可知，氧苷类异黄酮的单糖链与异黄酮通过C—O键相连，其稳定性较弱，因此在形成子离子时，容易断裂该C—O键，主要失去了分子量为162的碎片，形成糖苷配基的脱质子峰，而碳苷类异黄酮的单糖链与异黄酮通过C—C键相连，其稳定性强，不易断裂，在形成子离子时，一般失去分子量为120的碎片，从葛根素的质谱图中可以验证这一点。因此推断杂质A和杂质C应该都是碳苷类异黄酮，排除了染料木苷的可能。再根据二者在紫外分光光谱图的差异，杂质C最大吸收波长为265nm，且只有一个吸收峰，与文献报道一致，因此推测杂质A为3’一羟基葛根素，有关物质C为染料木素一8一葡萄糖苷。分别为有关物质A正、负离子模式下的各级质谱图。