本案例的工作目的是测定注射用高浓度尿促性素中黄体生成素的生物效价(实际上是相对于供试品标示量的相对效价百分比，简称“相对效价”)、评定尿促性素中黄体生成素相对效价的测得值的测量不确定度。

1 测量方法

1.1依据的文件

本品注射用高浓度尿促性素按国家食品药品监督管理局进口药品注册标准JX20090229【效价测定】项下规定：“取本品，照卵泡刺激素和黄体生成素生物检定法(中国药典2005年版二部附录ⅫM和ⅫN)测定，应符合规定。”本例具体测定方法依据《中国药典》2010年版二部，附录ⅫN黄体生成素生物测定法(附录P. 122)(与《中国药典》2015年版四部通则1217，第171页原则相同，细节有变化的地方在本文“1. 3. 1测定方法”中说明，细节变化不会影响不确定度的基本评定程序)。本法系比较尿促性素标准品(S)与供试品(T)对幼大鼠精囊增重的作用，以测定供试品中黄体生成素的效价。照生物检定统计法(《中国药典》2010年版二部附录ⅪV中“三、量反应平行线测定法”)(附录P.132～147)(与《中国药典》2015年版四部通则1431，第183-197页相同。)计算相对于标示量的相对效价百分比(本文设为P)。

相对效价限度：依据JX20090229，应为标示量的80％～125％。

1.2实验条件

1.2.1仪器设备

(1)电子分析天平

①型号：METTLER TOLEDOAB204S；最大量程：220g；实际分度值：d=0.1mg,检定分度值e=10d=1mg, (0～50)g量程MPEV=0.5e=0.5mg。

②型号：METTLER TOLEDOPL601-S；最大量程：610g；分度值：d=0.lg,e=10d=1g,(0～500)g量程MPEV=0.5e=0.5g。

(2)移液管(单标);1mL、5mL、10mL、25mL、50mL。

(3)容量瓶：100mL。

1.2.2试剂与供试品

(1)牛血清蛋白：纯度98％。

(2)标准品：尿促性素标准品(厂家提供，批号这里略去。规格：771U/amp，出厂时欠缺不确定度数据)(IU/amp：国际单位每安瓿)。

(3)供试品(供试品)：注射用高浓度尿促性素(厂家提供；批号这里略去，标示效价：75IU/amp)。

1.2.3实验环境

温度：23℃～25℃；相对湿度：40％～70％。

1.3测量方法与步骤

操作流程如图1所示：

图1 操作流程图

按《中国药典》2010年版附录及厂家提供标准，测定各步骤如下：

(1)溶液的制备

试验当日，称取牛血清白蛋白适量，加0.9％氯化钠溶液溶解，制成每1mL中含1mg的溶液，充分溶解后，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2±0.2。

(2)标准品溶液的制备

试验当日，按尿促性素标准品中黄体生成素的标示效价，用上述溶剂，按高、中、低剂量组(以d_s3、d_s2、d_s1表示高、中、低剂量浓度)制成3种浓度的标准品溶液，相邻两浓度比值(r)为1:0.5。高浓度标准品溶液为每1mL中含9单位。[2015版《中国药典》四部规定为8～15单位，不同于2010版的8～10单位]标准品溶液置4℃～8℃贮存[2015版《中国药典》四部规定为2℃～10℃贮存]，可供4日使用：具体操作如下：

①取尿促性素标准品6支(77IU/amp)。每支分别加入1.0mL溶媒溶解完全，合并，混匀，再加入溶媒至51.3mL(9IU/mL);

②精密吸取9lU/mL溶液25.0mL，加溶媒定容至50.0mL(4.5IU/mL) ;

③精密吸取4.5IU/mL溶液25.0mL，加溶媒定容至50.0mL(2.251U/mL)。

(3)供试品溶液的制备

按供试品中黄体生成素的标示量或估计效价(AT)，按照标准品溶液的制备法制成高、中、低(以d_T3、d_T2、d_T1表示高、中、低剂量浓度)3种浓度的供试品溶液，相邻两浓度比值(r)为1：0.5，供试品溶液为每1mL中含9单位。具体操作如下：

①取供试品6支(75IU/amp)，每支分别加入1.0mL溶媒溶解完全，合并，混匀，再加入溶媒至50.0mL(91U/mL);

②精密吸取91U/mL溶液25.0mL，加溶媒定容至50.0mL(4.5IU/mL);

③精密吸取4.51U/mL溶液25.0mL，加溶媒定容至50.0mL(2.25IU/mL)。

(4)测定过程

①取健康合格，出生19～23日，体重36g～50g[2015版《中国药典》四部规定为36g～60g]，同一来源的雄性幼大鼠，一次实验所用幼大鼠的出生日期相差不得超过3日，体重相差不得超过10g[2015版《中国药典》四部规定为不得超过15g]；体重随机等分成6组，每组不少于6只。每日于大致相同的时间分别给每鼠皮下注入一种浓度的标准品溶液或供试品溶液0.5mL，每日1次，连续注入4次。

②于最后1次注入24h后，将动物(雄性幼大鼠)处死，然后称量鼠体重(天平实际分度值0.1g)，解剖[2015版《中国药典》四部规定为将动物处死，称重，解剖]，摘出整个前列腺，由前叶和精囊交界处剥离出精囊，去除附着的组织，用滤纸吸去周围的液体，直接称量精囊重(天平实际分度值0.1mg)[2015版《中国药典》四部规定为直接称重(天平精密度0.1mg)“精密度”一词可能是2015版《中国药典》表达错误，电子天平没有精密度技术指标，应为“实际分度值”。－本文注)，并换算成每10g体重的精囊重(2010版无须换算)，涉及本例4.1.1.2.3和4.1.1.2.4会有点变化，本例检验是在2015版药典实施之前进行的，故按照2010版《中国药典》]，计算脏器系数：

脏器系数＝精囊重/鼠体重

照生物检定统计法(《中国药典》2010年版二部附录)：量反应测定法计算效价及实验误差。

(5)测定数据的可靠性检验及计算效价

①可靠性检验

偏离平行要求p>0.05,p为可靠性检验的置信概率。

可信限率FL≤35%。

本次测量(包括10次重复测量)，可靠性检验符合要求(检验的详细过程，经仔细研究，与不确定度评定无直接关联，此处从略)。

②计算效优

按式(1)计算效价比值R，再计算供试品相对于标示量的相对效价百分比P及供试品测得效价PT。依据《中国药典》2010年版二部“附录ⅪV生物检定统计法一、总则等反应剂量对比”的规定，脚注T表示供试品，PT丁含义如下：

“PT是通过检定测得T的效价含量，称T的测得效价，是将效价比值(R)用T的标示量或估计效价AT校正之后而得，即PT＝AT·R或PT＝AT·antilgM。”

效价比值R按下式计算：

式中：

R—效价比值，无量纲；

D—标液和试液的理论浓度比值，无量纲；

antilg—反常用对数符号；

I—标液和试液相同剂量溶液的高低浓度理论比值的对数，无量纲；

V—生物检验统计量，见式(4), mg/g;

W—生物检验统计量，见式(5),mg/g。

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文章来源：《食品药品检测测量不确定度评定实例》

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