13.1.5.1荧光定量分析

荧光分析法可用于对荧光物质进行定性和定量分析。荧光定性分析可采用直接比较法，即将试样与已知物质并列于紫外线下，根据它们所发出荧光的颜色和强度等来鉴定它们是否含有同一荧光物质。也可根据荧光发射光谱的特征进行定性鉴定。但由于能产生荧光的化合物占被分析物的数量是相当有限的，并且许多化合物几乎在同一波长下产生光致发光，所以荧光分析法较少用作定性分析。

目前荧光分析法主要用于对无机和有机化合物的定量分析。荧光定量分析的方法主要有校正曲线法和标准对照法。

(1)标准曲线法

根据荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系，先用已知量的标准物质经过和试样一样的处理后，配制一系列标准溶液，在一定条件下测定它们的荧光强度，以荧光强度对标准溶液浓度绘制校正曲线。然后在相同的仪器条件下，测定未知试样的荧光强度，从校正曲线上查出它们的浓度。

(2)标准对照法

如果荧光物质的校正曲线通过零点，就可以在线性范围内用标准对照法测定含量。具体做法是：在相同条件下，测定试样溶液和标准溶液的荧光强度，由二者荧光强度的比值和标准溶液的浓度可求得试样中荧光物质的含量。

13.1.5.2无机化合物的分析

无机化合物荧光分析有直接荧光法、荧光猝灭法、间接荧光法及催化荧光法等。

(1)直接荧光法

无机化合物能自身产生荧光用于测定的比较少，主要依赖于待测元素与有机试剂组成的能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度来测定该元素的含量，这种方法称为直接荧光法。现在可以利用有机试剂以进行荧光分析的元素已达到70多种。较常用荧光法分析的元素为铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。

(2)间接荧光法

许多有机物和绝大多数的无机化合物，有的不发荧光，有的因荧光量子产率很低而只有微弱的荧光，从而无法进行直接的测定，只能采用间接测定的方法。

间接荧光法常用于某些阴离子如F^-、CN^-等的分析，它们可以从某些不发荧光的金属有机配合物中夺取金属离子，而释放出能发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量。常用的有荧光衍生法。

荧光衍生法是通过某种手段使本身不发荧光的待测物转变为发荧光的另一种物质，再通过测定该物质来测定待测物的方法。荧光衍生法根据采用的衍生反应大致可分为化学衍生法、电化学衍生法和光化学衍生法。其中化学衍生法和光化学衍生法用得较多，尤其是化学衍生法用得最多。许多无机金属离子的荧光测定，一般就是通过它们与金属螯合剂反应生成具有荧光的螯合物之后加以测定的。

(3)荧光猝灭法

某些元素虽不与有机试剂组成会发荧光的配合物，但它们可以从其他会发荧光的金属离子-有机试剂配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致溶液荧光强度的降低，山降低的程度来测定该元素的含量，这种方法称为荧光猝灭法。有时，金属离子与能发荧光配位体反应，生成不发荧光的配合物，导致荧光配位体的荧光猝灭，同样可以测定金属离子的含量，这也属干荧光猝灭法。该法可以测定氟、硫、铁、银、钴、镍、钦等元素和氰离子。

对静态猝灭，荧光分子M与猝灭剂Q如果生成非荧光基态配合物MQ，则

由于荧光总浓度c_M=[M]+[MQ]，根据荧光强度与荧光分子M浓度的线性关系有

式中，I_0f与I_f分别为猝灭剂加入前与加入后试液的荧光强度。当猝灭剂的总浓度c_Q＜c_M时式(13-2)成立，且c_Q与[Q]之间成正比关系。同理，也可以推导出与此式完全相似的动态猝灭关系式。

与工作曲线法相似，对一定浓度的荧光物质体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂Q，配成一个荧光物质体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度。I_0f/I_f值对c_Q绘制工作曲线即可方便地进行工作。该法具有较高的灵敏度和选择性。

(4)催化荧光法

某些反应的产物虽能产生荧光。但反应速率很慢，荧光微弱，难以测定。若在某些金属离子的催化作用下，反应将加速进行，利用这种催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量。铜、铍、铁、钴、锇、银、金、过氧化氢及氰离子等都曾采用这种方法测定。

13.1.5.3有机化合物的分析

(1)脂肪族化合物

脂肪族化合物的分子结构较为简单，本身能产生荧光的很少，如醇、醛、酮、有机酸及糖类。但也有许多脂肪族化合物与某些有机试剂反应后的产物具有荧光性质，此时就可通过测量荧光化合物的荧光强度进行定量分析。

(2)芳香族有机化合物的分析

芳香族化合物具有共扼不饱和结构，大多能产生荧光，可以直接进行荧光测定。有时为了提高测定方法的灵敏度和选择性，还常使某些弱荧光的芳香族化合物与某些有机试剂反应生成强荧光的产物进行测定。例如，降肾上腺素经与甲醛缩合而得到强荧光产物，然后采用荧光显微法可以检测组织切片中含量低至10^-17 g的降肾上腺素。此外，氨基酸、蛋白质、维生素、胺类等有机物大多具有荧光，可用荧光分析法进行测定或研究其结构或生理作用机理。在现代的分离技术中，以荧光法作为检测手段，常可以测定这些物质的低微含量。

13.1.5.4多组分混合物的荧光分析

如果混合物中各组分的荧光峰相互不干扰，可分别在不同的波长处测定，直接求出它们的浓度。

如果荧光峰互相干扰。但激发光谱有显著差别，其中一个组分在某一激发光下不吸收光，不会产生荧光，因而可选择不同的激发光进行测定。

如果在同一激发光波长下荧光光谱互相干扰，可以利用荧光强度的加和性，在适宜的荧光波长处测定，利用列联立方程的方法求结果。

13.1.5.5其他应用

(1)溶液中单分子行为的研究

分子荧光方法利用激光诱导产生超高灵敏度，这已能实时检测到溶液中单分子的行为。目前，已观察到溶液中罗丹明6G分子，荧光素分子等及其标记的DNA分子的单分子行为。

(2)基因研究及检测

遗传物质的DNA自身的荧光效率很低，一般条件下几乎检测不到DNA的荧光。因此，人们常选用某些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来研究DNA与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。目前，典型的荧光探针分子为溴化乙锭(EB)。在基因检测方面，已逐步使用荧光柒料作为标记物来代替同位素标记，从而克服了同位素标记物产生的污染、价格昂贵及难保存等的不足。

文章来源：《分析化学分析方法的原理及应用研究》

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