一、案例

维生素D(vitaminD)为固醇类衍生物，又称抗佝偻病维生素，维生素D主要包括D2和D3两种。维生素D的主要功能是调节体内钙、磷代谢，维持血钙和血磷的水平，从而维持牙齿和骨骼的正常生长和发育，儿童缺乏维生素D，易发生佝偻病，是婴幼儿期常见的营养缺乏症之一，临床以多汗、夜惊、烦躁不安和骨骼改变为特征。维生素D部分存在于天然食物中，人体维生素D主要是紫外线的照射后，由体内7-脱氢胆固醇能转化而来，婴幼儿食品中需要添加维生素D强化剂。

二、选用的国家标准

GB 5413·9--2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素A、维生素D、维生素E的测定。

三、测定方法

1．试样处理

(1)含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约5g或液体试样约50g(精确到0．1mg)于250mL锥形瓶中，加入lg α一淀粉酶，固体试样需用约50mL 45～50℃的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于(60±2)℃培养箱内培养30min。

(2)不含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约10g或液体试样约50g(精确到0．1mg)于250mL锥形瓶中，固体试样需用约50mL 45~50℃水使其溶解，混合均匀。测定维生素D的试样需要做回收率实验。

2．待测液的制备

(1)皂化 于上述处理的试样溶液中加入约100mL 15g／L维生素c的乙醇溶液，充分混匀后加25mL氢氧化钾水溶液混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。在1000mL的烧杯中加入约300mL的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器上，当水温控制在(53±2)℃时，将锥形瓶放人烧杯中，磁力搅拌皂化约45min后，取出立刻冷却到室温。

(2)提取用少量的水将皂化液全部转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10min后静置分层，将水相转入另一500mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入500mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在(40±2)℃充氮条件下蒸至近干(绝不允许蒸干)。残渣用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。

从上述容量瓶中准确移取7.0mL石油醚溶液放入一试管中，将试管置于(40±2)℃的氮吹仪中，将试管中的石油醚吹干。向试管中加2.0mL正己烷，振荡溶解残渣，再将试管以不低于5000r／min的速度离心10min，取出静置至室温后为待测液。

3．维生素D待测液的净化

色谱参考条件如下。

色谱柱：硅胶柱，150mmX4.6mm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：环己烷与正己烷按体积比1：1混合，并按体积分数0.8％加入异丙醇。

流速：lmL／min。

波长：264nm。

柱温：(35±1)℃。

进样体积：500μL。

取约0．5mL维生素D标准储备液于10mL具塞试管中，在(40±2)℃的氮吹仪上吹干。残渣用5mL正己烷振荡溶解。取该溶液50μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D的保留时间。然后将500μL待测液注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液的保留时间收集维生素D馏分于试管中。将试管置于(40±2)℃条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入1．0mL甲醇，残渣振荡溶解，即为维生素D测定液。

4．维生素D测定液的测定

参考色谱条件如下。

色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：甲醇。

流速：lmL／min。

检测波长：264nm。

柱温：(35±1)℃。

进样量：100μL。

（1）标准曲线的绘制 分别准确吸取维生素D2(或D3)标准储备液0.20mL、0．40mL、0．60mL、0．80mL、1.00mL于100mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0．200μg／mL、0．400μg／mL、0.600μg／mL、0.800μg／mL、1.000μg／mL。分别将维生素D2(或D3)标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素D2(或D3)标准工作液浓度为横坐标分

（2）维生素D标准储备液须在-10℃以下避光储存，标准工作液临用前配制，标准储备溶液用前需校正。

（3）本法维生素D检出限为0．20μg／l00g。