高效液相色谱法是采用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对样品进行分离测定的色谱方法。注入的样品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内获得分离并进入检测器检测，由数据处理系统记录和处理色谱信号。

一、基本理论

高效液相色谱法是经典液相色谱法与气相色谱法的基本原理和实验方法相结合的成果。色谱理论需解决色谱分离过程中的热力学和动力学两个方面的问题，即分离和柱效的影响因素与提高柱效的途径，柱效的评价指标以及色谱参数间的关系等等。

(一)分配系数与容量因子

HPLC法的分离是利用物质在流动相与固定相之间分配的微小差异，当两相作相对移动时，待测物质在两相间进行反复多次分配，使原来微小的分配差异逐步放大，从而使各组分获得分离。

分配系数(partition coefficient, K)是指在一定的温度和压力下，物质在两相中达到平衡后，组分在固定相中的浓度(c_S)与流动相中的浓度(c_M)之比，即：

分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，仅与固定相与温度有关。如果两个组分具有相同的分配系数，则无法采用HPLC法将其分离，反之，分配系数差异越大，越能获得更好的分离效果。

由于不易获得固定相中组分的浓度参数，因此，在实际工作中常用容量囚子(capacity factor, k)表示，容量因子也称为容量比或分配比，是指某一组分在两相间分配达到平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，即：

将分配系数代入，可得到分配系数与容量因子之间的关系：

容量因子是衡量色谱柱对待测组分保留能力的重要参数，同样也取决于组分及固定相的热力学性质，不仅随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。

(二)色谱流出曲线与色谱峰

样品随着流动相通过色谱柱，经过检测器后，由检测器所形成的电信号强度对时间作图，所得到的曲线称为色谱流出曲线，亦即浓度一时间曲线，如图14-1所示。

图14-1 色谱流出曲线与色谱峰

保留值用时间表示称为保留时间，用体积表示称为保留体积。保留时间(t_R)是指组分从进样到柱后出现峰极大值时所需要的时间，是色谱法定性的基本依据，也是药物分析中常用的参数。当采用另一组分作为标准物或参比进行测定时，可以将保留值之比作为定性参数，称为相对保留时间，该参数只与柱温和固定相的性质有关，而与柱内径、柱长、填充情况以及流速无关，更加准确地描述了对两种组分的分离情况，因此在色谱法中被广泛用作定性参数。

区域宽度是反映色谱峰峰宽的参数，可用于衡量柱效以及反映色谱操作条件的动力学因素。通常用标准偏差σ、半峰宽W_h/2和峰底宽度W_b三种方法表示。从色谱流出曲线可以获得以下重要信息：

1．根据色谱峰个数，可判断样品中所含组分的最少个数。

2．根据色谱峰的保留值，可进行定性分析。

3．根据色谱峰峰面积或峰高，可进行定量分析。

4．根据色谱峰的保留值及其区域宽度，可对色谱柱的分离效能做出判断。

5．两色谱峰之间的距离，是评价固定性选择是否合适的重要依据。

文章来源：《实用化学药品检验检测技术指南》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。