手性药物对映体在人体内与受体、酶等生物大分子相互作用，呈现出复杂的对映体选择性，进一步表现为不同的药理作用、代谢过程和毒性反应。对于手性药物，可能其中一个对映体活性高、疗效好，为活性对映体(优对映体)；另外的活性低甚至没有活性的为劣对映体。由于劣对映体没有药效或药效较低，甚至可能产生严重的不良反应，基于此，FDA于1992年率先发布了手性药物指导原则，我国亦于2006年颁布了《手性药物质量控制研究指导原则》。为了评价手性药物的生物活性，监测对映体的光学纯度，建立和发展快速准确的药物对映体分离方法具有重要的意义。

手性高效液相色谱法通常分为直接法和间接法。间接法又称手性衍生化试剂法(chiral derivatization reagent, CDR)，是将对映体与手性光学试剂反应，生成一对非对映异构体之后以常规固定相分离，因此是对手性衍生物的非手性分离。而直接法则是采用手性固定相法(chiral stationary phase, CSP)或将手性化合物加入到流动相中，再用常规固定相分离的手性流动相法(chiral mobile phase, CMP)。手性固定相法因其使用简便快捷、重复性好、准确度高、应用范围广而倍受青睐。

一、手性色谱柱的分类

目前，已商品化的手性固定相有100多种，根据手性固定相和溶剂的相互作用机制，Irving Wainer首次提出了手性色谱柱的分类体系：

第1类：通过氢键、π-π作用、偶极-偶极作用形成复合物；

第2类：既有1类中的相互作用，又存在包埋复合物。此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱；

第3类：基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。这类手性色谱柱中最典型的是环糊精型手性柱，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚(苯基甲基甲基丙烯酸酯)形成的手性色谱柱也属于此类；

第4类：基于形成非对映体的金属络合物，是由Davankv 开发的手性分离技术，也称为．手性配位交换色谱(CLEC)；

第5类：蛋白质型手性色谱柱，手性分离是基于疏水相互作用和极性相互作用得以实现的。

手性色谱柱亦可按照固定相的化学结构分为蛋白质柱、多聚糖柱、环糊精、Pirkle型柱、配体交换柱和硅胶键合大环抗生素六种类型。

二、色谱参数对分离度的影响

反相条件下，可通过对流动相的pH值、缓冲盐浓度、缓冲盐类型、有机改性剂浓度和种类等色谱参数的调节，获得满意的分离结果。

以AGP手性填料为例，AGP是手性分离中最常用的手性填料，能分离酸性、碱性以及酯、醇类手性化学药品。等电点为2.7，改变流动相的pH值可以调节填料的净负电荷量，进而改变待测物质和蛋白质填料间的作用力，从而改变手性物质的保留时间以及手性对映体以及非对映体的分离度。如表14-7所示，在AGP柱上流动相pH值的变化对氟比洛芬、罗呱卡因、反式-2-苯基环丙基硼酸以及西替利嗪四种外消旋化合物对映体分离度的影响，显然对映体在AGP柱上分离效果与流动相pH之间相关程度与样品的结构有关。

改变流动相中缓冲盐的浓度，也能够影响酸性或碱性手性药物的保留时间和分离度。如图14-26所示的萘普生分离结果。随着磷酸钠浓度的增加，在蔡普生的保留时间增加的同时，萘普生对映异构体的分离度也有显著增加。

表14-7 流动相pH值对对映体分离结果的影响

图14-26 缓冲盐浓度对萘普生手性对映体分离的影响(A：0.01mol/LB:0.05mol/LC:0.1mol/L)

色谱柱：Chiral-AGP柱，100mm×4.0mm

流动相：磷酸钠缓冲液(pH=7.0)

增加流动相中甲醇、乙腈、异丙醇等有机改性剂的浓度，通常酸性和碱性药物的保留时间和对映体的分离度都降低。但是也有例外，比如华法林，以10mmol/L磷酸钠缓冲液(pH=7.0)-异丙醇为流动相时，流动相中异丙醇的含量从8％增加到14％时，手性异构体间的相对保留时间从1.33增加到1.57。

在缓冲液中加入不同性质的有机改性剂，可以改变手性柱的选择性和分离能力。如图14-27所示的吲哚洛尔手性对映体的分离中，添加5％的正丙醇，完全不能分离，在流动相中添加10％的乙腈后，对映异构体得到完全分离。

图14-27 不同有机改性剂对吲哚洛尔手性对映体分离的影响

色谱柱：Chiral-AGP柱，100mm×4.0mm

流动相：10mmol/L磷酸钠缓冲液(pH=7.3), A：加入10％的乙腈；B：加入5％的正丙醇

蛋白质手性柱的样品荷载量小，不适于半制备或制备分离。

多聚糖手性固定相因其种类多、耐用性好、专属性强及载样量大而得到广泛应用。由于水和卤代烃都能溶解纤维素及其衍生物，故流动相大多为正相色谱系统，如正己烷-乙醇、异丙醇等。在流动相组成中，醇类添加剂的种类和浓度等都会对分离产生一定的影响。在分离碱性药物时，在流动相中添加适量的二乙胺，可抑制硅胶单体表面残存的硅羟基的非立体选择性吸附，增强固定相的手性识别能力。

三、手性色谱柱在药品标准中的应用

化学药品中有相当多的手性药物或消旋体，大部分的手性药物在药典或国家标准中并不采用手性柱进行对映体检查，更多是通过比旋度进行控制。随着药品注册管理组织对药品安全性要求的不断提高，手性药物质量标准中手性异构体的检查已经成为常态。我国新药标准中大多数手性药物采用手性柱进行手性杂质的检查。《中国药典》2015年版二部中大部分的手性药物如左羟丙哌嗪(图14-28)、右酮洛芬氨丁三醇(图14-29),缬沙坦(图14-30)等也都采用了手性柱进行手性杂质的检查。

图14-28 左羟丙哌嗪手性异构体的检查
色谱柱：CHIRAPAK AD-H柱，4.6mm×250mm，5um
流动相：正己烷-无水乙醇-二乙胺(80：20：0.2)
检测波长：237nm

图14-29 右酮洛芬氨丁三醇手性异构体的检查
色谱柱：Kromasil CHI-TBB柱，4.6mm×250mm , 5um
流动相：正己烷-叔丁基甲醚-冰醋酸(65：35：0.1)
检测波长：254m

图14-30 缬沙坦手性异构体的检查
1．异构体；2.缬沙坦
色谱柱：Chiralcel-AGP柱，150mm×4.0mm
流动相：磷酸缓冲液(pH=7.0)-异丙醇(98：2)
检测波长227nm

相关链接：高效液相色谱法在含量测定中的应用

文章来源：《实用化学药品检验检测技术指南》

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