7 测定步骤

7.1 提取

称取2g脂肪样品，精确到0.01g，置于50 mL具塞离心管中，加入5 mL乙腈，于60℃水浴中保持3min，使固体脂肪融化。用液体混匀器(5.6)涡旋1 min，于-5℃以3500r/min离心7 min，吸取上清液至15 mL 具塞聚丙烯离心管中，再向沉淀物中加入5 mL乙腈重复提取一次，合并上清液。向合并的乙腈提取液中加入2mL、正己烷，涡旋1 min，于-5℃以3500 r/min离心5 min，弃去正己烷层，乙腈相再用2 mL正己烷重复洗涤一次，弃去正己烷层。乙腈提取液于60℃用氮气浓缩仪吹干。

7.2 皂化

向乙腈提取液(7.1)中依次加入4 mL正己烷、1mL氢氧化钠溶液(4.12)和0.5 mL氯化镁溶液(4.11)，于液体混匀器上快速混匀10s，在60℃水浴中保持15 min，于-5℃以3500 r/min离心5 min,吸取上清液至15 mL玻璃离心管中。向沉淀物中再加入4 mL正己烷，混匀，于60℃水浴中加热15 min后，于-5℃以3500 r/min离心5 min，合并上清液。于60℃用氮气浓缩仪吹干，用1.0 mL正己烷溶解残渣，待净化。

7.3 净化

将上述样液(7.2)移入氰丙基固相萃取柱中(4.19)，用2 mL正己烷分两次润洗玻璃试管，洗液也移入固相萃取柱中。待样液流出后，依次用5 mL正己烷和6 mL乙酸乙酯＋正己烷溶液(4.8)淋洗固相萃取柱，淋洗液流出后，固相萃取柱抽干2 min，最后用3.5 mL乙酸乙酯＋正己烷溶液(4.9)洗脱，洗脱液收集于另-15 mL玻璃离心管中，于60℃用氮气浓缩仪吹干。残余物用990 uL乙腈＋水(4.13)涡旋溶解，静止 15 min后，加入10 uL盐酸溶液(4.10),混匀，过0.2 um滤膜后，供液相色谱测定。

7.4 测定

7.4.1 液相色谱条件

a)色谱柱：Kromasil C₁₈，5um,250mm×4.6mm(内径)或相当着;

b)预柱：C₁₈，5um,12.5mm×4.6mm(内径)；

c)流动相：乙腈+水(65+35)

d)流速：:1.0mL/min;

e)柱温：35℃；

f)检测波长：292nm;

g)进样量：40 uL。

7.4.2 液相色谱测定

用混合标准工作溶液(4.18)分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准物质的液相色谱图。

7.5 平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.6 回收率试验

阴性样品中添加标准溶液，按7.1～7.3操作，测定后计算样品添加的回收率。

8 结果计算

结果按式(1)计算：

式中：

X—试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

c—从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL) ;

V—试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；

m—最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。

9 精密度

本标准的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95％的可信度来计算。

9.1 重复性

在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，试样中被测物的含量范围及重复性方程见表1和表2。

表1 牛脂肪中三种孕酮的含量范围及重复性和再现性方程

表2 猪脂肪中三种孕酮的含量范围及重复性和再现性方程

如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.2 再现性

在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中被测物的含量范围及再现性方程见表1和表2。

文章来源：《化学试剂标准汇编》

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