牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定(二)
来源/作者:中国标准物质网  日期:2019-01-29

5 仪器和设备

5.1 液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子源。

5.2 分析天平:感量0.1 mg和0.01g。

5.3 匀质机。

5.4 高速组织匀浆机。

5.5 低温高速离心机:转速大于4000r/min。

5.6 高速离心机:转速大于12000 r/min。

5.7 超声波。

5.8 旋涡振荡器。

5.9 振荡水浴。

5.10 氮气浓缩仪。

5.11 固相萃取装置。

5.12 旋转蒸发器。

5.13 KD浓缩瓶。

6 试样制备与保存

6.1 试样的制备

取样品约500 g用组织捣碎机捣碎,装入洁净容器作为试样,密封,并标明标记。

6.2 试样的保存

将试样于-18℃保存。

7 测定步骤

7.1 酶解

准确称取5g试样,准确至0.01g,置于50 mL离心管中,依次加入200 uL内标混合工作溶液(4.17)、10 mL磷酸盐缓冲液(4.8),以14000r/min均质30 s,加入60 uL葡萄糖苷酸酶硫酸酯酶(4.7) ,混匀30 s,置于37℃恒温振荡水浴中酶解16 h。

7.2 提取

酶解后的样品溶液(7.1)加10 mL甲醇,混匀2 min,置冰浴中放置5 min,在5℃以4000r/min离心10 min,上清液转移至50 mL离心管中,下层沉淀再用5 mL甲醇重复上述操作一次,合并上清液至上述50 mL离心管中,向离心管中加入 15 mL叔丁基甲醚,振摇5 min,以4 000 r/min离心5 min,上层溶液转移至125 mL分液漏斗中,下层溶液依次再用15 mL、10 mL叔丁基甲醚提取两次,合并上层溶液至上述分液漏斗中,加入10 mL饱和氯化钠水溶液(4.9),振摇30 s,静置分层,上层溶液转移至梨形瓶中,在40℃旋转蒸发至干.残渣中加入1.5 mL甲醇.涡旋1 min,超声5 min,再加入20 mL水,混匀,待净化。

7.3 净化

将样品提取液(7.2)转移至已活化的C18固相萃取柱(4.19)上。用5mL水洗涤梨形瓶,洗涤液合并至C18固相萃取柱中,以≤2mL/min流速使样液通过固相萃取柱,待样液过柱后,用5 mL水淋洗C18固相萃取往.弃去淋洗液,用10 mL甲醇将待测组分从C18固相萃取柱上洗脱.洗脱液转移至梨形瓶中,在40℃旋转蒸发至干。肌肉样品用0.5mL甲醇溶解残渣,涡旋1 min,加入0.5 mL水混匀,过0.2um滤膜,供液相色谱-串联质谱测定。

肝脏样品的洗脱液蒸干后,向梨形瓶中加入0.5 mL三氯甲烷,涡旋1 min,加入5 mL正己烷,超声1 min,然后转移至已活化的硅胶固相萃取柱(4.20)中,以1 mL/min流速使样液通过固相萃取柱,待样液过柱后,用5 mL正己烷淋洗硅胶固相萃取柱,弃去淋洗液,用6 mL水饱和乙酸乙酯(4.10)洗脱待测组分,洗脱液转移至KD接收瓶中,在40℃旋转蒸发至干,加0.5 mL甲醇,涡旋1 min,加入0.5 mL水混匀,过0.2 um滤膜,供液相色谱-串联质谱测定。

称取阴性样品,按7.1、7.2和7.3步骤制备空白样品提取液,用于配制系列基质混合标准工作溶液。

7.4 测定

7.4.1 液相色谱条件

a)色谱柱:C18色谱柱,5um,150 mm×2.1mm(内径);

b)柱温:40℃;

c)进样量:20uL;

d)流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。

表1流动相、流速及梯度洗脱条件

7.4.2 质谱条件

a)离子源:电喷雾离子源;

b)扫描方式:正离子扫描;

c)检测方式:多反应监测;

d)雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体,使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求;

e)喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度;

f)定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表2。

表2 睾酮、表睾酮和孕酮及内标物的质谱参数

文章来源:《化学试剂标准汇编》

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【关键词】葡萄糖苷酸酶 甲醇 乙酸乙酯 正己烷 三氯甲烷