5 仪器和设备

5.1 液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源。

5.2 分析天平：感量0.1 mg和0.01g。

5.3 匀质机。

5.4 高速组织匀浆机。

5.5 低温高速离心机：转速大于4000r/min。

5.6 高速离心机：转速大于12000 r/min。

5.7 超声波。

5.8 旋涡振荡器。

5.9 振荡水浴。

5.10 氮气浓缩仪。

5.11 固相萃取装置。

5.12 旋转蒸发器。

5.13 KD浓缩瓶。

6 试样制备与保存

6.1 试样的制备

取样品约500 g用组织捣碎机捣碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。

6.2 试样的保存

将试样于-18℃保存。

7 测定步骤

7.1 酶解

准确称取5g试样，准确至0.01g，置于50 mL离心管中，依次加入200 uL内标混合工作溶液(4.17)、10 mL磷酸盐缓冲液(4.8)，以14000r/min均质30 s，加入60 uL葡萄糖苷酸酶和硫酸酯酶(4.7) ,混匀30 s，置于37℃恒温振荡水浴中酶解16 h。

7.2 提取

酶解后的样品溶液(7.1)加10 mL甲醇，混匀2 min，置冰浴中放置5 min，在5℃以4000r/min离心10 min，上清液转移至50 mL离心管中，下层沉淀再用5 mL甲醇重复上述操作一次，合并上清液至上述50 mL离心管中，向离心管中加入 15 mL叔丁基甲醚，振摇5 min，以4 000 r/min离心5 min，上层溶液转移至125 mL分液漏斗中，下层溶液依次再用15 mL、10 mL叔丁基甲醚提取两次，合并上层溶液至上述分液漏斗中，加入10 mL饱和氯化钠水溶液(4.9)，振摇30 s，静置分层，上层溶液转移至梨形瓶中，在40℃旋转蒸发至干．残渣中加入1.5 mL甲醇．涡旋1 min，超声5 min，再加入20 mL水，混匀，待净化。

7.3 净化

将样品提取液(7.2)转移至已活化的C₁₈固相萃取柱(4.19)上。用5mL水洗涤梨形瓶，洗涤液合并至C₁₈固相萃取柱中,以≤2mL/min流速使样液通过固相萃取柱，待样液过柱后，用5 mL水淋洗C₁₈固相萃取往．弃去淋洗液，用10 mL甲醇将待测组分从C₁₈固相萃取柱上洗脱．洗脱液转移至梨形瓶中，在40℃旋转蒸发至干。肌肉样品用0.5mL甲醇溶解残渣，涡旋1 min，加入0.5 mL水混匀，过0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

肝脏样品的洗脱液蒸干后，向梨形瓶中加入0.5 mL三氯甲烷，涡旋1 min，加入5 mL正己烷，超声1 min，然后转移至已活化的硅胶固相萃取柱(4.20)中，以1 mL/min流速使样液通过固相萃取柱，待样液过柱后，用5 mL正己烷淋洗硅胶固相萃取柱，弃去淋洗液，用6 mL水饱和乙酸乙酯(4.10)洗脱待测组分，洗脱液转移至KD接收瓶中，在40℃旋转蒸发至干，加0.5 mL甲醇，涡旋1 min，加入0.5 mL水混匀，过0.2 um滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

称取阴性样品，按7.1、7.2和7.3步骤制备空白样品提取液，用于配制系列基质混合标准工作溶液。

7.4 测定

7.4.1 液相色谱条件

a)色谱柱：C₁₈色谱柱，5um,150 mm×2.1mm(内径)；

b)柱温：40℃；

c)进样量：20uL;

d)流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。

表1流动相、流速及梯度洗脱条件

7.4.2 质谱条件

a)离子源：电喷雾离子源；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)检测方式：多反应监测；

d)雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；

e)喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度；

f)定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表2。

表2 睾酮、表睾酮和孕酮及内标物的质谱参数

文章来源：《化学试剂标准汇编》

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