1 范围

本标准规定了牛肌肉、肝、肾中a-群勃龙、β-群勃龙残留量的液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱测定方法。

本标准适用于牛肌肉、肝、肾中a-群勃龙、β-群勃龙残留量的测定。

本标准的方法检出限：a-群勃龙、β-群勃龙的液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法的检出限均为2 ug/kg。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GB/T 6379.1-2004，ISO 5725-1：1994，IDT)

GB/T 6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T 6379. 2-2004,ISO 5725-2:1994,IDT)

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-1992,neq ISO 3696:1987)

3 原理

试样在pH=5.0条件下加酶水解，用乙酸乙酯提取群勃龙残留，经凝胶色谱净化仪(GPC)和硅胶柱净化，用配有紫外检测器的液相色谱仪或用液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。

4 试剂和材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

4.1 甲醇：色谱纯。

4.2 乙酸：色谱纯。

4.3 乙腈：色谱纯。

4.4 乙酸乙酯。

4.5 环己烷。

4.6 丙酮。

4.7 正己烷。

4.8 β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯(β-glucuronidase and aryl sulfatase)：100000 unit/mL。

4.9 乙酸乙酯＋环己烷：50+50。

4.10 丙酮＋正己烷：10+90。

4.11 丙酮＋正己烷：30+70。

4.12 乙酸钠缓冲液：0.02 mol/L, pH=5.0,称取无水乙酸钠0.82g溶于500 mL水中，用乙酸调节pH=5.0。

4.13 a-群勃龙、β-群勃龙标准物质：纯度≥98％。

4.14 标准储备溶液：分别精确称取a-群勃龙、β-群勃龙标准物质(4.13)各0.0100g，用乙腈(4.3)溶解并定容至100 mL，配制成100ug/mL的标准储备溶液。此溶液-18℃冷冻保存，可使用六个月。

4.15 混合标准工作溶液：取标准储备溶液(4.14)各5 mL至50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成混合标准工作溶液，浓度为10 ug/mL，此溶液-18℃冷冻保存，可使用三个月。

4.16 硅胶固相萃取柱：500 mg, 3 mL；使用前用5 mL丙酮＋正己烷(4.10)预处理，保持柱体湿润。

4.17 0.45 um滤膜。

5 仪器和设备

5.1 液相色谱仪配有紫外检测器。

5.2 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。

5.3 凝胶色谱仪。

5.4 均质器。

5.5 旋转蒸发仪。

5.6 旋涡混合器。

5.7 离心机：最大转速5000r/min。

5.8 氮气浓缩仪。

5.9 恒温水浴摇床。

6 试样的制备与保存

6.1 试样的制备

牛肌肉、肝、肾组织用组织捣碎机绞碎，分出0.5 kg作为试样备用。

6.2 试样保存

制备好的试样置于-18℃冰柜中避光保存。

7 测定步骤

7.1 混合基质标准校准溶液的制备

7.1.1 试样的称取

称取5个阴性样品，每个样品为5g(精确到0.01g)，置于50 mL具塞离心管中，再分别加入不同量混合标准工作溶液(4.15)，使各被测组分的浓度均为2.5 ng/mL、5ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。

7.1.2 提取

向上述盛有5个阴性样品的50 mL具塞离心管中，加入5 mL乙酸钠缓冲液(4.12)和20 uL β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯(4.8)，摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床(5.9)上，37℃振荡水解过夜(≥5h)。待水解液冷却至室温后，加入20 mL乙酸乙酯，在均质器(5.4)上以10 000 r/min的速度均质提取1 min后，3000r/min离心(5.7)10 min，将上清液过滤至鸡心瓶中。再用20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。

7.1.3净化

7.1.3.1 凝胶色谱仪(GPC)条件

a)净化柱：22g S-X3 Bio-Beads填料，200目～400目，200 mm×25 mm(内径)或相当者；

b)流动相：乙酸乙酯＋环己烷(50+50)，流速5.0mL/min;

C)定量环：5 mL;

d)净化程序：0 min～10.5 min弃去洗脱液，10.5 min～15.5 min收集洗脱液，15.5 min～18 min弃去洗脱液。

7.1.3.2 GPC及硅胶固相萃取净化

将提取液在45℃下蒸至近干，用乙酸乙酯＋环己烷(4.9)定容至10 mL的玻璃试管中，按7.1.3.1中GPC条件净化。净化后将收集的洗脱液蒸干，用3 mL丙酮＋正己烷(4.10)旋涡振荡(5.6)溶解残渣，将溶液转移到预洗过的硅胶固相萃取柱(4.16)上的贮液器中，然后再用3 mL丙酮＋正己烷(10+90)溶解一次，将合并的溶解液过硅胶固相萃取柱，接着用3 mL丙酮＋正己烷(10+90)淋洗硅胶柱，最后用5 mL丙酮＋正己烷(4.11)洗脱分析物并收集。洗脱液用氮气浓缩仪(5.8)在60℃水浴中吹干，用1 mL流动相旋涡振荡溶解，过0. 45 ftm滤膜(4.17)供液相色谱-紫外检测和液相色谱-串联质谱测定。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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