1 范围

本标准规定了牛尿中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。

本标准适用于牛尿中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定。

本标准的方法检出限：牛尿中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮均为2ug/L。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GB/T 6379.1-2004，ISO 5725-1：1994，IDT)

GB/T 6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T 6379. 2-2004, ISO 5725-2 ;1994, IDT)

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-1992,neq ISO 3696:1987)

3 原理

试样在pH=5.0条件下加酶水解，经免疫亲和柱净化，用液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。

4 试剂和材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

4.1 甲醇：色谱纯。

4.2 乙腈：色谱纯。

4.3 乙酸：色谱纯。

4.4 β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯(P-glueuronidase and aryl sulfatase)：100000 unit/mL。

4.5 氢氧化钠溶液：1 mol/L。10g氢氧化钠溶于250 mL水中。

4.6 盐酸溶液：1 mol/L。吸取20.8 mL浓盐酸溶于水中，定容至250 mL。

4.7 免疫亲和柱淋洗缓冲储备液和柱贮存缓冲储备液：免疫亲和柱附带。

4.8 柱淋洗缓冲溶液：量取1 mL储备溶液与19mL水混溶，临用前现配。

4.9 柱贮存缓冲溶液：量取1 mL储备溶液与4 mL水混溶，临用前现配。

4.10 甲醇＋水溶液：70+30。

4.11 a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮标准物质：纯度≥98％。

4.12 标准储备溶液：分别精确称取a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮标准物质(4.11)各0.0100g，用乙腈(4.2)溶解并定容至100 mL，配制成100 ug/mL的标准储备溶液。此溶液-18℃冷冻保存，可使用六个月。

4.13 混合标准工作溶液：取标准储备溶液(4.12)各5 mL置于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成混合标准工作溶液，浓度为10 ug/mL，此溶液-18℃冷冻保存，可使用三个月。

4.14群勃龙/19-乙烯去甲睾酮免疫亲和柱：带有柱淋洗缓冲储备溶液和柱储存缓冲储备溶液，在2℃～8℃保存。

4.15 0.45 um滤膜。

5 仪器和设备

5.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)

5.2 离心机：最大转速5 000 r/min。

5.3 恒温水浴摇床。

5.4 旋涡混合器。

5.5 氮气浓缩仪。

5.6 固相萃取装置。

6 试样的制备与保存

6.1 试样的制备

取新鲜牛尿迅速冷冻作为试样备用。

6.2试样保存

制备好的试样置于-18℃冰柜中避光保存。

7 测定步骤

7.1 基质混合标准校准溶液的制备

7.1.1 试样的称取

取5个阴性样品，将冷冻尿液融化混匀，取部分样品以转速4 000 r/min离心10 min。然后，每个样品分别量取5 mL(精确到0.01 mL)于15 mL具塞离心管中，再分别加入不同量混合标准工作溶液(4.13)，使各被测组分的浓度均为2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。

7.1.2 水解

分别将上述离心管溶液，用1 mol/L 的盐酸(4.6)调节尿样pH值在4.9～5.1之间，接着加入40uL β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯(4.4)，摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床(5.3)上37℃振荡水解2h。待水解液冷却至室温后，加入4 mL柱淋洗缓冲溶液(4.8)，用1 mol L氢氧化钠溶液(4.5)调整尿样pH值在7～9之间。

7.1.3 免疫亲和柱净化

首先将柱贮存缓冲溶液(4.9)过柱，再用15 mL柱淋洗缓冲溶液平衡柱子。然后，将水解处理好的尿样过柱，接着依次用8 mL柱淋洗缓冲溶液、5 mL水淋洗柱子。最后，用4 mL甲醇＋水榕液(4.10)洗脱分析物并收集于带刻度的试管中(上述过程过柱流速应≤2mL/min)。洗脱液用氮气浓缩仪(5.5)在60℃水浴中吹至约1 mL，用流动相定容至2 mL，旋涡振荡(5.4)混合，过0.45 um滤膜(4.15)供Lc-MS-MS测定。

注：为确保柱子在下次使用时无残留影响，应继续用10 mL甲醇＋水溶液(70+30)洗涤柱子。若接着使用此柱，则重复7.1.3步骤。若不再使用，应用15 mL柱贮存缓冲溶液洗涤柱子，最后柱内保留5 mL柱贮存缓冲溶液，2℃～8℃保存。此柱能重复使用10次左右。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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