7 测定步骤

7.1 提取

称取6 g试样，精确到0.01g，置于50 mL具塞聚丙烯离心管中，加入30 mL 0.1 mol/L Na₂EDTA-Mcllvain缓冲溶液(pH=4)(4.11)，于液体混匀器上快速混合1 min，再用振荡器振荡10 min，以10000r/min离心10 min，上清液倒入另一离心管中，残渣中再加入20 mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液。

7.2 净化

将上清液(7.1)倒入下接Oasis HLB固相萃取柱(4.17)的贮液器中，上清液以砚3 mL/min的流速通过固相萃取柱，待上清液完全流出后，用5 mL甲醇＋水(4.12)洗柱，弃去全部流出液。在65 kPa的负压下、减压抽干40 min，最后用15 mL乙酸乙酯(4.3)洗脱，收集洗脱液于100 mL平底烧瓶中。

将上述洗脱液在减压情况下以镇3 mL/min的流速通过羧酸型阳离子交换柱(4.18)，待洗脱液全部流出后，用5 mL甲醇(4.1)洗柱，弃去全部流出液。在65 kPa负压下，减压抽干5 min，再用4 mL流动相(4.13)洗脱，收集洗脱液于5 mL样品管中，定容至4 mL，供液相色谱-紫外检测器测定。

7.3 测定

7.3.1 液相色谱条件

a) 色谱柱：Mightsil RP-18 GP,3 um,150 mm×4.6 mm或相当者；

b) 流动相：乙腈＋甲醇+0.01 mol/L草酸溶液(2+1＋7)；

c) 流速：0.5 mL/min;

d) 柱温：25℃；

e) 检测波长：350 nm;

f) 进样量：60 uL。

7.3.2 液相色谱测定

将混合标准工作溶液(4.16)分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间见表1。

表1 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素参考保留时间

7.4 平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.5 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。

8 结果计算

结果按式(1)计算：

式中：

X—试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)

c—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(ug/mL) ;

V—试样溶液定容体积，单位为毫升(mL) ;

m—试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。

注：计算结果应扣除空白值。

9 精密度

本标准的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值以95％的可信度来计算。

9.1 重复性

在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素含量范围及重复性方程见表2。

表2 含量范围及重复性和再现性方程

如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.2 再现性

在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的含量范围及再现性方程见表2。

相关链接：可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定（一）

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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