6 试样的制备与保存

6.1 试样的制备

猪肝脏、肾脏要去除脂肪和其他的非肝脏、肾脏组织，猪肉要去皮和骨头。将其搅碎拌匀。分出0.5kg作为试样，将制备好的试样密封，并做上标记。

6.2 试样保存

将试样置于-18℃条件下贮存。

7 测定步骤

7.1 提取

称取试样5.00g(精确到0.01g)放入50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL的甲醇＋乙腈溶液(50+50)匀浆1 min，用2×1mL的甲醇＋乙腈溶液(50+50)彻底清洗匀浆头。高速振荡10 min，离心15min(4000r/min)，将上清液转移至40 mL的洁净离心管中。再向残渣中加入2 mL甲醇＋乙腈溶液(50+50)匀浆30s，依上述条件清洗匀浆头。高速振荡5 min,离心10min(4000r/min)。合并两次上清液于40 mL离心管中。加入15 mL的0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(4.9)，高速振荡5 min，离心10min(4000r/min)。将上清液转移至150 mL的鸡心瓶中，加入80 mL磷酸二氢铵溶液(4.9)混匀待净化。

7.2 净化

依次用5 mL乙腈,5 mL水和5 mL的磷酸二氢铵溶液(4.9)洗涤活化固相萃取柱(5.17)。在柱上装上玻璃贮液器(5.19)，将样液(7.1)过柱，移去玻璃贮存器(5.19)。依次用2 mL水，10 mL水＋乙腈溶液(80+20),2 mL水和水＋甲醇溶液(65+35)洗柱，弃去全部流出液。最后用5 mL水＋甲醇溶液(45+55)洗涤维吉尼霉素M₁，收集洗脱液到15 mL的玻璃离心管中。将10 mL三氯甲烷(4.5)加入洗脱液中，振荡5 min，离心10 min(4000r/min)。用一次性移液管定量收集三氯甲烷层到10 mL离心管中，在40℃条件下氮吹至干。再向离心管中加入500uL甲醇，超声5 min，加入500uL甲酸铵缓冲液(4.11)，高速涡旋5s。样液用0.22um的滤膜过滤到样品瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。

7.3 色谱测定

7.3.1 液相色谱条件

a) 色谱柱：SunFire C₁₈, 5 um ,150 mm×2.1 mm(内径)或相当者；

b) 柱温:40℃；

c) 进样量：30uL;

d) 色谱柱总流量：300uL/min;

e) 流动相及梯度见表1。

表1 流动相及梯度

7.3.2 质谱条件

a) 离子源：电喷雾离子源；

b) 扫描方式：正离子扫描；

c) 检测方式：多反应检测；

d) 电喷雾电压(IS):5000V;

e) 雾化气压力(CAST) :517.1 kPa;

f) 气帘气压力(CUR): 103.4 kPa;

g) 辅助气压力(CAS2) :620.5 kPa;

h)离子源温度(TEM)：700℃；

i)定性离子对、定量离子对、采集时间(Dwell)、去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)、入口电压(EP)及碰撞室出口电压(CXP)，见表2。

表 2维吉尼霉素M₁的质谱参数

7.3.3 液相色谱-串联质谱测定

7.3.3.1 定性测定

每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在±2.5％之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

7.3.3.2 定量测定

用标准工作溶液(4.19)分别进样，以峰面积为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中维吉尼霉素M₁的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述的色谱条件和质谱条件下，维吉尼霉素M₁的参考保留时间为24.35 min。

7.4 平行试验

按照以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.5 回收率试验

空白样品中添加标准溶液按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。

8 结果计算

试样中维吉尼霉素M₁残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：

式中：

X—试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ug/kg) ;

c—从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—样品溶液定容体积，单位为毫升(mL);

m—样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。

注：计算结果应扣除空白值。

9 精密度

本标准的精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值以95％的可信度来计算。

9.1 重复牲

在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，猪肾组织维吉尼霉素M₁中的含量范围及重复性方程见表4。

表4 猪肾组织中维吉尼霉素M₁的含量范围及重复性和再现性方程

如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.2 再现性

在线性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，猪肾组织中维吉尼霉素M1的含量范围及再现性方程见表4。

相关链接：猪肝脏、肾脏、肌肉组织中维吉尼霉素M1残留量的测定（一）

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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