5 仪器和设备

5.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。

5.2 分析天平：感量0.1mg和0.01g。

5.3 氮气浓缩仪。

5.4 固相萃取装置：配有真空泵。

5.5 低温离心机：-5℃至室温，最大转速5000r/min。

5.6 液体混匀器。

5.7 恒温水浴。

5.8 微波炉。

5.9 移液器：10uL～100uL，和100uL～1000uL。

6 试样制备与保存

6.1 试样的制备

取样品500 g搅拌混匀，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。

6.2试样的保存

如果制备好的试样不立刻测定，则将测试样置于4℃中保存。

7 测定步骤

7.1 样品称量

7.1.1 牛奶样品

称取10g(精确到0.01g)牛奶样品，置于50 mL具塞聚丙烯离心管中。

7.1.2 奶粉样品

称取1g样品(精确到0.01g)，置于50 mL具塞聚丙烯离心管中，然后加入8倍质量的水溶解后混匀。

7.2 样品提取

加1.0 mL氨水(4.9) ,混匀。加入10 mL 95％乙醇(4.10),混匀后加入10 mL乙酸乙酯(4.4)，振摇1 min，再加入10 mL石油醚(4.11)，同样振摇1 min，以4000r/min离心5 min，吸取上层提取液通过装有15 g无水硫酸钠的玻璃柱过滤到50 mL具塞聚丙烯离心管中。再用8 mL乙酸乙酯(4.4)和8 mL石油醚(4.11)重复提取残液一次，以4000r/min离心5 min，提取液过相同的无水硫酸钠的玻璃柱，用5 mL乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱后，合并提取液，提取液于60℃用氮气浓缩仪吹干。

加入5 mL乙腈，于60℃水浴中保持3 min，使脂肪融化。涡旋1 min，于一5℃以4000r/min离心7 min，吸取上清液至15 mL具塞聚丙烯离心管中，再向沉淀物中加入5 mL乙腈重复提取一次，合并上清液。向合并的乙腈提取液中加入2 mL正己烷(4.5) ,涡旋1 min，于一5℃以4000r/min离心5 min，弃去正己烷层，再用2 mL正己烷重复洗涤乙腈相，弃去正己烷层。乙腈提取液于60℃用氮气浓缩仪吹干。

7.3 皂化

向乙腈提取液(7.2)中依次加入4 mL正己烷(4.5)、1 mL氢氧化钠溶液(4.16)和0.5 mL氯化镁溶液(4.15)，于液体混匀器上快速混匀10s，在60℃水浴中保持15 min，于-5℃以4000r/min离心5 min，吸取上清液至15 mL离心管中。向沉淀物中再加入4 mL正己烷，混匀，于60℃水浴中加热15 min后，于-5℃以4000r/min离心5 min，合并上清液。于60℃用氮气浓缩仪吹干，用1.0mL正己烷溶解残渣，待净化。

7.4 净化

将上述样液(7.3)移入氰丙基固相萃取柱中(4.23)，用2 mL正己烷分两次润洗玻璃试管，洗液也移入固相萃取柱中。待样液流出后，依次用5 mL正己烷和6 mL乙酸乙酯＋正己烷溶液(1+19)(4.13)淋洗固相萃取柱，淋洗液流出后，固相萃取柱抽干2 min，最后用3.5 mL乙酸乙酯＋正己烷溶液(1+4)(4. 14)洗脱，洗脱液收集于另一15 mL离心管中，于60℃用氮气浓缩仪吹干。残余物用1 mL乙腈＋水(7+3)(4.17)涡旋溶解，过滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

7.5 测定条件

7.5.1 液相色谱参考条件

液相色谱参考条件如下：

a)色谱柱：C₁₈柱，3um, 50 mm×2.0 mm(内径)或相当者；

b)柱温：30℃；

c)流速：0.3 mL/min;

d)进样量：10uL ;

e)梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

7.5.2 质谱参考条件

质谱参考条件如下：

a)离子源：正离子电喷雾；

b)扫描方式：多反应检测MRM;

c)电喷雾电压：4000V ;

d)离子源温度：350℃；

e)雾化气、气帘气、辅助气：均为高纯氮气，使用前调节各气流流量，以使质谱仪灵敏度达到检测要求；

f)定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量见表2。

表2 定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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