7 测定步骤

7.1 提取

准确称取奶粉0.5g，精确至0.001g，置于50 mL聚丙烯离心管中。在避光条件下，加入10 mL丙酮溶液(4.6)，振荡提取约3 min。以5000 r/min低温离心5 min，移取上清液至一干净的15 mL离心管，于30℃氮吹浓缩至少于1 mL。用丙酮溶液(4.6)定容至1 mL，在液体混合器上充分振荡混匀，样液过0.2 um滤膜，用液相色谱仪测定，外标法定量。

7.2 测定条件

7.2.1 液相色谱参考条件

a)色谱柱：YMCT'TM Carotenoid, 5um, 250 mm×4.6 mm(内径)或相当者；

b)柱温：25℃；

c)流速：1.0 mL/min;

d)检测波长：445 nm;

e)进样量：50uL;

f)梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

7.2.2 液相色谱测定

用叶黄素标准工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中叶黄素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，叶黄素的参考保留时间为6.09min。

7.3 平行试验

按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.4 空白试验

除不加标外，均按上述分析步骤进行。

8 结果计算

外标法定量，按式(1)计算试样中叶黄素含量：

式中：

X—样品中待测组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);

c—从标准工作曲线得到的试样溶液中待测组分的浓度，单位为毫克每升(mg/L) ;

V—试样溶液定容体积，单位为毫升(mL);

m—最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。

计算结果应扣除空白值。

9 精密度

9.1 一般规定

本标准精密度数据是按照GB/T 6379.1和GB/T 6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值以95％的可信度来计算。

9.2 重复性

在重复性试验条件下，试样中叶黄素含量在1.0 mg/kg～50.0mg/kg，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，重复性限按式(2)计算：

1g r＝0.719 5 1g m-1.171 2······(2)

式中：

m—两次测定值的平均值，单位为毫克每千克(mg/kg)。

如果两次测定值的差值超过重复性限r，则应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.3 再现性

在再现性试验条件下，试样中叶黄素含量在1.0 mg/kg～50.0mg/kg，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，再现性限按式(3)计算：

R＝0.121 5 m＋0.0031······(3)

式中：

m—两次测定值的平均值，单位为毫克每千克(mg/kg)。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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