6 分析步骤

6.1 试样溶液的制备

称取0.1g～0.2g试样，精确到0.001g，置于50 mL容量瓶内，加入40 mL甲醇，在60℃的超声波水浴中，振荡40 min，待样品完全溶解后，取出冷却至室温。然后用甲醇定容至50 mL～100 mL，摇匀。用注射过滤器将试样溶液过滤至样品瓶内，摇匀后，供液相色谱仪测定。过滤的样液取1 mL与1 mL水混合后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

6.2 测定

6.2.1 液相色谱条件

6.2.1.1 串联质谱法

a)色谱柱：Mightysil RP-₁₈ 3 um 150 mm×4.6mm(内径)或相当者；

b)流动相：甲醇＋水(65+35)，用磷酸(4.2)调节流动相至pH=3;

c)流速：0.3mL/min;

d)进样量：20 uL。

6.2.1.2 紫外检测法

a)色谱柱：Mightysil RP-₁₈ 3 um 150 mm×4.6mm(内径)或相当者；

b)流动相：甲醇＋水(58+42)，用磷酸(4.2)调节流动相至pH=3;

c)流速：0.7mL/min;

d)检测波长：270nm;

e)进样量：10 uL。

6.2.2 质谱条件

a)扫描方式：正离子扫描；

b)检测方式：多反应检测；

c)电喷雾电压：4000 V ;

d)雾化气压力：0.055 MPa;

e)气帘气压力：0.069 MPa;

f)辅助气流速：6 L/min;

g)离子源温度：380℃；

h)去簇电压：100V;

i)定性离子对、定量离子对和碰撞气能量，见表1。

表1 八种黄酮化合物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压

6.2.3 测定

6.2.3.1 液相色谱-串联质谱检测法测定

用芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素标准储备溶液配成的混合标准工作溶液(4.6)分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素的保留时间见表2。

表2 八种黄酮化合物的参考保留时间

6.2.3.2 液相色谱紫外检测法测定

根据试样溶液中每种黄酮化合物含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和试样溶液中每种黄酮化合物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。对标准工作溶液和试样溶液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，八种黄酮化合物出峰顺序和保留时间见表3。

表3 八种黄酮化合物的参考保留时间

6.3 平行试验

按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。

6.4 空白试验

除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。

相关链接：蜂胶中芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定方法（一）

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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