5 仪器

5.1 液相色谱仪：配有紫外检测器。

5.2 液体混匀器。

5.3 均质机。

5.4 离心机：最高转速5000r/min,

5.5 移液器：10uL～100uL和100uL～1000uL。

6 试样的制备与保存

6.1 试样的制备

取样品约500 g用组织粉碎机粉碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。

6.2 试样的保存

将试样于-18℃冰箱中保存。

7 测定步骤

7.1 提取

称取2g试样，精确至0.01g，置于50 mL离心管中，加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液(4.10)，均质1 min，于3000r/min离心10 min，上清液移入25 mL棕色容量瓶中。沉淀物用10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液重复提取一次，于3000 r/min离心10 min，合并上清液于上述容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度。

7.2 衍生

移取上述提取液(7.1)1.0 mL，放入5 mL容量瓶中，依次加入100 uL 2 mol/L氢氧化钠溶液(4.11) , 300 uL饱和碳酸氢钠溶液(4.12)和2 mL 10mg/mL丹酰氯溶液(4.13)，盖塞，于40℃避光反应45 min。反应完毕后，加入100 uL 氢氧化铵(4.8)，静置30 min，用乙腈(4.2)定容至刻度，振荡混匀，取适量的溶液通过滤膜(4.17)后，供液相色谱测定。

混合标准工作溶液衍生：取适量混合标准工作溶液于5 mL容量瓶中，加入300 uL饱和碳酸氢钠溶液和2 mL 10 mg/mL丹酰氯溶液，盖塞，于40℃避光反应 45 min。反应完毕后，加入100 uL氢氧化铵，静置30 min，用乙腈定容到5.00mL，振荡混匀，取适量的溶液通过滤膜。

7.3 测定

7.3.1 液相色谱条件

a)色谱柱：Kromasil C₁₈ , 5 um, 250 mm×4.6 mm(内径)或相当者。

b)柱温：35℃。

c)流动相：A : 0.01mol/L乙酸铵；B：水＋乙腈(10+90)含0.01 mol/L 乙酸铵。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

d)检测波长：254 nm。

e)进样量：10 uL。

7.3.2 色谱测定

用混合标准工作溶液(7.2)分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中七种生物胺的响应值均应在仪器测定的线性范围内。

7.4 平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.5 回收率试验

阴性样品中添加标准溶液，按7.1～7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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