1．概述

皮革水解物是将皮革用化学的方法进行水解，由于动物的皮毛主要成分是蛋白质，因此水解产物被称为皮革水解蛋白，添加到食品中可以提高蛋白质的含量。皮革水解物的生产原料主要来自制革工厂的边角废料，而其中往往含有重铬酸钾和重铬酸钠。因此皮革水解物含有危害人体健康的重金属六价铬，含有致癌物，不能用于食品加工。

目前发现可能添加的食品有乳制品、含乳饮料。与三聚氰胺不同，皮革水解物是真正的蛋白质，若添加到乳制品、乳饮料当中，检测起来难度比三聚氰胺更大。

2．乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定

动物水解蛋白中的特有成分为L-羟脯氨酸和羟赖氨酸，且羟脯氨酸的含量较高，达10％以上，而大豆蛋白与乳蛋白中不含有此成分。通过对羟脯氨酸的测定，就可鉴定乳与乳制品中是否添加了动物水解蛋白的成分。

1)检测原理

试样经酸水解，释放出羟脯氨酸。经氯胺T氧化，生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558nm处进行比色测定。

2)检测范围

引用标准GB 9695.23-7.990《肉与肉制品L(-)-羟脯氨酸含量测定》。本方法适用于乳与乳制品中L(-)-PAC脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。

3)试剂

所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。

(1)氯化亚锡(GB 638-2007) : 0.75％溶液。将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中，再加入500mL浓盐酸(GB 622-1989)。

(2)盐酸(GB 622-1989)：6mol/L溶液。

(3)氢氧化钠(GB 629-1997)：1mol/L、10mol/L溶液。

(4)缓冲液：将50g柠檬酸，26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB 694)溶于水，稀至1L，此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。

(5)氯胺T (HG3-972 )溶液：将1.41g氯胺T,溶于10mL水中，依次加入10 mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。

(6)显色剂：称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸(GB623)溶解，缓慢加入65mL异丙醇。

(7) L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。

①标准储备液500ug/mL：称取50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解，加一滴6mol/L盐酸，定容至100mL容量瓶中。

②标准工作液5ug/mL：吸取标准储备液5.00mL于500mL容量瓶中，定容。

4)仪器和设备

(1)配有冷凝管的三角瓶：250mL。

(2)恒温水浴。

(3)试管加热器或水浴，可控温于60℃。

(4)分光光度计。

5)试样处理

(1)方法1。准确称取样品2～5g(液体样品5～10g)放入250mL磨口三角瓶中。加几粒沸石。加入氯化亚锡溶液100mL，置水浴上加热回流16h。趁热将水解溶液过滤于200mL容量瓶中，用6moL/L热盐酸10mL反复3次冲洗三角瓶和滤纸，冷却，用水定容到刻度，混匀。吸取5～25mL(V1)水解液于100mL烧杯中，用10mol/L,1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8±0.2，过滤于250mL容量瓶中，用30mL水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀，反复3次，把洗液并入滤液中，以水洗至刻度，摇匀备用。

(2)方法2。准确称取一定量样品，精确到0.0001g，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内，将称好的样品放于水解管中。在水解管内加6mol/L盐酸10～15mL(视样品蛋白质含量而定)或加入12mol/L盐酸10～15mL，含水量高的样品(如牛乳)可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空(接近0)，然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复3次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解24h后(如加入12mol/L盐酸，水解时间可缩短至6h)后，取出冷却。

打开水解管，趁热将水解溶液过滤于100mL三角瓶中，用6moL/L热盐酸10mL反复三次冲洗试管和滤纸，冷却，用水定容到刻度，混匀。吸取5～25mL (V1)水解液于100mL三角瓶中，用10mol/L、1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8±0.2，过滤于50mL容量瓶中，用水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀，反复3次，把洗液并入滤液中，以水洗至刻度，摇匀备用。

6)检测步骤

(1)测定。标准曲线的绘制：吸取L (-)-羟脯氨酸标准工作液0.00、10.00、20.00、30.00、40.00mL，分别置于100mL容量瓶中，定容摇匀。浓度分别为0.0、0.5、1.0、1.5、2.0ug/mL。取不同浓度的上述溶液4.00mL，分别加入20mL具塞试管中，加氯胺T溶液2mL，摇匀后于室温放置20min。加入显色剂2mL，摇匀，塞上塞子于60℃试管加热器(或恒温水浴)中保温20min后取出，迅速冷却，在波长558nm±2 nm处测定吸光值，绘制标准曲线。

(2)试样测定。从待测液中吸取已制备好的样液4.00mL于20mL具塞试管中，以下按6)中(1)步骤进行，同时作空白试验。

7)结果计算

式中：X—样品中L(-)-羟脯氨酸的含量，％；

c—从标准曲线上查得相应的L(-)-羟脯氨酸量，ug;

m—称取试样的质量，g；

V₁—样液体积，mL;

A—稀释倍数。

当符合允许差所规定的要求时，取两次测定结果的算术平均值作为结果，结果精确到0.01％。

8)允许差

同一分析者同时或相继进行的两次测定结果之差不得超过平均值的5％。

9)结果判定

因L(-)-羟脯氨酸为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10％以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。

文章来源：《食品安全快速检测技术》

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