一、案例

四环素类抗生素(Tcs)是一类碱性广谱抗生素，包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素等，在畜禽生产中被广泛地用作饲料添加剂来防治动物疾病和提高饲料利用率。在我国，由于四环素药的用量很大，有些地方使用不合理及滥用，导致四环素成为牛乳及乳制品中残留最多的抗生素。牛乳是人们尤其是婴幼儿的主要营养食品，牛乳中残留的抗生素会危害饮用者身体健康。

二、选用的国家标准

GB／T 22990—2008牛乳和乳粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。

三、测定方法

1．试样的制备与保存

牛乳置于0～4℃冰箱中避光保存。使用时，从冰箱中取出，放置至室温，摇匀。乳粉常温避光保存。

2．提取与净化

牛乳试样称取10.OOg，置于50ml。具塞塑料离心管中，乳粉试样称取2.OOg，置于50mL具塞塑料离心管中，向试样中加入20mL O.1mol／L Na2 EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH=4)，于涡旋振荡器上混合2min，于10℃，5000r／min离心10min，上清液过滤至另一离心管中，残渣中再加入20mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液，待净化。
将上清液通过处理好的Oasis HLB固相萃取柱，使上清液以不超过3mL／min的流速通过Oasis HLB固相萃取柱，待上清液完全流出后，用5mL甲醇+水(体积比5+95)洗柱，弃去全部流出液。减压抽干5min，最后用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中。

将上述洗脱液通过羧酸型阳离子交换柱，待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇洗柱，减压抽干，用4mL O.01mol／L草酸一乙腈溶液洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中，45℃下氮气吹至1.5mL左右，定容至2mL，供测定。

3．测定

(1)液相色谱条件

①色谱柱：Kromasil 100—5C18，5µm，150mm×4．6mm(内径)或相当者。

②流动相：O.01mol／L草酸溶液+乙腈+甲醇(77+18+5)。

③流速：1.O—mL／min。

④柱温：40℃。

⑤检测波长：350nm。

⑥进样量：60µL。

(2)液相色谱测定 将混合标准工作溶液分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标．绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。

(3)平行试验 按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。

4．结果计算

X=c*V/m*1000/1000

式中 X——试样中被测组分残留量，µg／kg；

c ----从标准工作曲线得到的被测组分溶液的浓度，ng／mL；

V——试样溶液定容体积，mL；

m——试样溶液所代表的质量，g。

注：计算结果应扣除空白值。

5．试剂

①甲醇：色谱纯。

②乙腈：色谱纯。

③磷酸氢二钠(Na2 HPO4·12H2O)。

④柠檬酸(C6H8O7·H2O)。

⑤乙二酸四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)。

⑥草酸(C2H2O4·2H2O)。

⑦0.2mol／L磷酸氢二钠溶液：称取71.63g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。

⑧0.1mol／L柠檬酸溶液：称取21.04g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL。

⑨Mcllvaine缓冲溶液：将625mL 0.2mol／L。磷酸氢二钠溶液与1000mL 0.1mol／L柠檬酸溶液混合，必要时用NaOH或HCl调pH=4.00±0.05。

⑩0.1mOL／L Na2EDTA—Mcllvaine缓冲溶液：称取60.50g乙二酸四乙酸二钠放入1625ml。Mcllvaine缓冲溶液中，使其溶解，摇均。

⑩0.01mol／L草酸溶液：称取1.26g草酸，用水溶解，定容至1000mL。

⑥甲醇+水(1+19)。

⑩0.01mol／L草酸一乙腈溶液(1+1)：量取50mL草酸溶液与50mL乙腈混均。

⑩土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质：纯度≥96％。

⑥0.1mg／mL土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储存溶液：准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质，分别用甲醇配成0.1mg／mL的标准储存液。储存液于一20℃保存。

⑩土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准工作溶液：根据需要用流动相将土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储存溶液，稀释成所需溶度的混合标准工作液。储存于冰箱中，每周配置。

⑩OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。

⑧羧酸型阳离子交换柱：500mg，6mL。使用前用5mL甲醇预处理，保持柱体湿润。

6．仪器

①液相色谱仪：配有紫外检测器。

②分析天平：感量0.1mg。

③涡旋振荡器。

④冷冻离心机：转数大于5000r／min。

⑤固相萃取装置。

⑥真空泵。

⑦氮气吹干仪。

⑧pH计：测量精度±0．02。

⑨刻度样品管：10mL，精度为O.1mL。