一、案例

磺胺类药物是一类应用最早的人工合成抗菌药物，能抑制革兰阳性菌及一些阴性菌，可以治疗多种细菌感染，具有抗菌谱广、疗效强等优点。磺胺类药物特别是磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异嗯唑等作为饲料添加剂或动物疫病治疗药物被广泛应用。然而磺胺类药物在体内作用时间和代谢时间较长，过量使用必会导致磺胺类药物在食用动物产品中的蓄积。食品磺胺类药物残留，可引起过敏、中毒和导致耐药性菌的产生，它还能引起造血系统障碍，发生急性溶血性贫血、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血等。

二、选用的标准

农业部1025号公告-7—2008动物性食品中磺胺类药物残留检测——酶联免疫吸附法。

三、测定方法

1．样品的制备与保存

取新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。取鸡蛋去除壳后用均质器500r／min匀浆20s，使蛋清和蛋黄充分混合。将已制备的样品在-20℃冰箱中储存备用。

2．提取

称取样品(2.00±0.02)g于50ml离心管中，加乙腈8mL，振荡20min，4000r／min离心5min：分取上清液2.5ml。于10mL离心管中，于50℃水浴下用氮气吹干；加正己烷1mL，涡动20s溶解残留物，再加缓冲液工作液1mL，涡动1min，4000r／min离心10min，取下层水相20µL分析。

3．测定

①使用前将试剂盒于室温(19～25℃)下放置1～2h。

②每个标准溶液和试样溶液按两个或两个以上平行计算，将所需数目的酶标板条插入板架。

③加系列标准溶液或试样液20µL于对应的微孔中，随即加酶标记物工作液50µL／孔，再加磺胺类药物抗体工作液80µL／孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，置25℃避光反应60min。

④倒出微孔中的液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体。再加洗涤工作液250µL／孔，重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。

⑤加底物液A液和B液各50µl／孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，室温下避光反应30min。

⑥加终止液50µL／孔，轻轻振荡混匀，置酶标仪于450nm波长处测量吸光度值。

4．结果判定和表述

用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。

相对吸光度值(％)=B/B0×100％

式中 B一一标准(试样)溶液的吸光度值；

B0——空白(浓度为0的标准溶液)的吸光度值。

将计算的相对吸光度值(％)对应磺胺类药物标准品浓度(µg／L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。

方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证的方法进行确证。

5．竞争物的交叉反应率

见表1。

表1竞争物的交叉反应率

6．试剂

①乙腈。

②正己烷。

③十二水合磷酸氢二钠。

④二水合磷酸氢二氢钾。

⑤氯化钠。

⑥氯化钾。

⑦磺胺类药物快速检测试剂盒：2～8℃保存。

a．系列标准工作溶液：O、1µg／L、3µg／L、9µg／L、27µg／L、81µg/L。

b．包被有磺胺类药物偶联抗原的96孔板，12×8孔。

c．磺胺类药物抗体工作液。

d．酶标记物工作液。

e．底物液A液。

f．底物液B液。

g．终止液。

h．20倍浓缩洗涤液。

i．20倍浓缩缓冲液。

⑧洗涤工作液：用水将20倍浓缩液按1：19的体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于酶标板的洗涤。2～8℃保存，有效期1个月。

⑨缓冲工作液：用水将20倍浓缩缓冲液按1：19的体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于酶标板的洗涤。2～8℃保存，有效期1个月。

7．仪器

①酶标仪(配备有450nm滤光片)。

②氮气吹干装置。

③均质器。

④振荡器。

⑤离心机。

⑥天平(感量0.01g)。

⑦微量移液器(单道20～200／µl、100～1000µL；多道250µL)。