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抗体的制备(四)

发布时间:2019-05-14 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:893

(三)细胞筛选

细胞筛选分为初筛和复筛,初筛为筛选阳性孔,复筛为筛选有竞争的孔。

1.初筛

杂交瘤细胞在融合10d左右即可进行筛选,笔者研究小组采用ELISA方法检测阳性细胞株,包被抗原为与免疫抗原不同的载体蛋白偶联的抗原(2ug·mL-1),每孔吸100uL细胞巨清液到酶标板中,做好标记,并设定阴性、阳性对照,酶稀液为阴性对照,融合鼠的血清为阳性对照,血清100倍稀释,37℃孵育1h,加羊抗鼠酶标二抗,每孔100uL, 37℃孵育30min, TMB显色10min后终止,酶标仪读数。细胞E清液取出后及时补液,补液为120uL HT培养基,并将阳性高的孔标记好顺序。

2. 复筛

第二天将标记好的阳性高的孔取出120uL上清液用于竞争检测,左侧酶标板:50uL酶稀释液+50uL细胞上清液为对照;右侧酶标板:50uL一定浓度的标准品(用酶稀释液配制)+50uL浏细胞上清,37℃孵育1h加羊抗鼠酶标二抗,每孔100uL,37℃孵育30min, TMB显色10min后终止,酶标仪读数。OD左侧酶标板/OD右侧酶标板,比值高的孔为竞争结果好的,选择OD值高的且竟争好的孔进行亚克隆并转入24孔。

阳性细胞株稳定性及抗体性能鉴定:阳性细胞转入24孔后,待细胞长势较好并达到一定数量时(细胞生长约占孔底面积的1/4~1/3),可取样检测滴度和可特异性、交叉反应性等,测滴度一般从1:1开始3倍或5倍梯度稀释,然后根据滴度结果测抗体特异性和交叉反应性,标准品浓度根据最终抗体所要达到的灵敏度来进行稀释。

(四)亚克隆

由于融合早期的杂交瘤细胞很不稳定,易丧失抗体分泌能力,因此应尽早进行亚克隆(细胞生长约占孔底面积的1/4~1/3)。亚克隆一般需要进行2~3次,细胞即可稳定下来,第一次亚克隆可接每孔5个细胞左右以保住阳性,即一板铺750个细胞;第二次亚克隆可接每孔3个细胞左右,即一板铺450个细胞;最后一次亚克隆接每孔一个细胞。即一板铺150个细胞。亚克隆前需铺饲养细胞,用含16%血清的HT培养基,方法同细胞融合前铺饲养细胞。

亚克隆后一周左右可进行亚克隆筛选,待克隆长势较好,一个克隆有几十个细胞以卜时可取样筛选,包被抗原2ug·mL-1,取上清液100uL检测阳性,选择阳性高的,并尽量选择单克隆的孔,待细胞长势好并长到一定数量后转入24孔(细胞生长约占孔底面积的1/4~1/3),转孔前需在24孔板中铺饲养细胞,转孔后24~72h进行滴度测定,选择滴度高的孔再次进行亚克隆,直至100%的孔为阳性。选出几株滴度高的且为单克隆的细胞株进行扩大培养,冻存保种,每株冻存需5只以上,最后选出最好的一株细胞用于腹水制备,选出来的细胞株可进行亚类测定。

(五)腹水制备

(1)打降植烷在腹水制备前7~10天,需打降植烷于BALB/C经产鼠(未怀孕)腹腔内,每只鼠200uL。

(2)注射杂交瘤细胞调整细胞至对数期,打降植烷7~10d后,将皿底细胞吹起,计数,取出足量细胞,每只鼠需注射2×106个,1200r·min-1离心5 min后,弃上清液,用生理盐水洗2遍,再用生理盐水稀释杂交瘤细胞,每只鼠注射0.2~0.5mL。

(3)取腹水 注射杂交瘤细胞后,注意观察小鼠肚子,一般在第6~7天后小鼠肚子鼓起,此时可取腹水,采用多次少取的方式取腹水。准备50mL离心管,将20mL注射器针头插在小鼠腹部,注意不要扎到小鼠内脏,下面放50mL离心管,来回抽动针头,腹水便留到离心管中,每次取3mL左右,每天观察小鼠肚子,若鼓起便取腹水,一般取3~5次,直到取完为止。若腹水中有血,需要立即3000r·min-1离心5 min,取仁清液,注意不要吸仁层的白色部分(即降植烷),腹水需放置干-20℃保存。

腹水鉴定合格后,用Protein A亲和柱按照说明书对抗体进行纯化。

文章来源:《环境样品前处理技术》

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