抗体的结合密度和非固相免疫吸附剂
来源/作者:中国标准物质网  日期:2019-05-14

一、抗体的结合密度

结合密度就是单位重量或单位床体积的固相载体上结合的抗体的量,用mg·g-1或mg·mL-1表示。结合密度是表征免疫亲和吸附剂特性的一个重要参数,是免疫亲和萃取柱制备过程中控制重现性的重要指标。结合密度可以通过分光光度法、折射光度法、放射性标记测量等方法,测量固定化前后溶液中抗体的浓度的减少值,计算得到。

活化载体的比表面积是影响免疫亲和吸附剂结合密度的一个重要因素。理论上,增加固相载体的表面积有利于提高抗体的结合密度:一般来说,单位体积的固相载体,其孔径越小则比表面积越大,但是,由于抗体蛋白的分子体积较大,如果载体的孔径过小则抗体难以进入;另外,固相载体的孔径如果过大虽有利于抗体的固定,但比表面积也相对减少,所以,在选择合适孔径的载体时必须兼顾这两方面的影响口研究表明,对小分子化合物的免疫萃取而言,载体的孔径为抗体分子直径的10倍,即50nm左右,最为适宜。例如,Hayashi等比较了孔径为10~400nm的免疫亲和固相吸附剂对多肤小分子的免疫萃取能力,结果表明载体的孔径为50nm时,免疫吸附剂的萃取能力最高。又如,Pichon等用孔径分别为300nm和50nm的硅土固定异特隆、阿特拉津、西玛津抗体,50nm硅土上固定的抗体的量和免疫容量均是300nm硅土的2倍左右。

另外一个影响抗体结合密度的因素使抗体的纯度。如果将未经纯化的抗血清直接用来固定化,则抗血清中的杂质蛋白会占据一定的结合位点,使抗体的结合密度降低。使用纯化抗体可以提高抗体的结合密度。用酶直接将抗体的Fab片断切割,分离,然后在固相载体上固定,更可以显著提高抗体的结合密度。

二、非固相免疫吸附剂

抗体除了被固定在固相载体材料上作为固相免疫吸附剂之外,借助一些特殊的装置,水相中的游离抗体也可以被直接用作免疫吸附剂。例如,超滤离心管是底部或侧面装有超滤膜的离心管,超滤膜的孔径只能允许一定尺寸的物质通过,对于蛋白来说,这种尺寸表现为截流分子量。市售的超滤离心管有从5kDa到500kDa多种不同的截流分子量。超滤离心管中的样品在离心力的作用下将向超滤膜移动。分子量小于截流分子量的小分子物质可以通过超滤膜,而大分子物质则被保留在离心管中,从而实现了样品中小分子物质与大分子物质的分离,这也是实验室中一种常用的蛋白浓缩或脱盐技术。Haasnot等首先借助超滤离心管和游离抗体对尿液样品中的价肾β-腺受体激动剂沙丁胺醇(salbutamol)进行了免疫亲和萃取。他们首先将沙丁胺醇多克隆抗体与尿样(以1:50稀释于PBS中)在截流分子量为30kDa的超滤离心管中混合,反应一段时间后,离心,将没有反应的小分子物质除去。然后向离心管中加入解离剂(甲醇,0.1mol·L-1醋酸=1:1,体积比),离心,收集滤液,滤液蒸干后用ELISA分析萃取的沙丁胺醇。与没有经亲和萃取的方法相比,亲和萃取后的检测限降低了30倍。

免疫支载液体膜(immuno-SLM)萃取也是直接利用水相中的游离抗体作为免疫吸附剂。支载液体膜萃取是近年来发展起来的一种新型膜萃取技术,其原理在本书其他章节有详细介绍。在此不再赘述。免疫支载液体膜萃取与支载液体膜萃取的不同之处如图8-6所示,作为富集相(receptor)的水相中含有游离的抗体。目标化合物穿过有机相后在水相中被抗体捕获,这样一方面目标化合物无法再扩散回有机相,另一方面由于抗体的使用进一步提高了方法的选择性。immuno-SLM已被用于4-硝基苯酚、阿特拉津等的免疫亲和萃取。利用荧光流动免疫分析(FFIA)检测地表水及果汁中阿特拉津时,样品基质的干扰很大,但经免疫支载液体膜萃取后基质干扰大大降低,阿特拉津检测限降低了10倍,方法对自来水、橙汁、河水中阿特拉津(5ug·L-1)的回收率在104%~115%之间。


图8-6 支载液体膜免疫亲和萃取装置示意图

与固相免疫亲和萃取相比,非固相免疫亲和萃取不需要那些可能对抗体活性造成较大影响的抗体固定化步骤,并且抗体的用量可以根据需要自由调节,抗体储存技术成熟,因此具有操作简单、萃取效率高、重现性好等特点。

文章来源:《环境样品前处理技术》

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【关键词】4-硝基苯酚 沙丁胺醇 中国标准物质