免疫吸附剂的制备
来源/作者:中国标准物质网  日期:2019-05-14

免疫吸附剂的制备过程涉及固相载体的预处理、抗体固定化、未偶联位点的封闭,以及清洗保存等步骤,其中抗体固定化过程是影响免疫吸附剂性能的关键。

理想的抗体固定化条件应具有以下特点:缓冲液pH值为4~9(在IgG的等电点0.5~2个pH单位);缓冲液的离子强度为0.01~0.5mol·L-1;温度为4~25℃;固定化反应时间应小于16h;总之,在抗体的固定化过程中应尽量减少对抗体活性的影响。

直接或通过双功能试剂,使抗体分子上的自由氨基、羟基基团与活化的固相载体共价结合,是常用的抗体固定化方法。常用到的双功能试剂有:1,4-丁二醇环氧丙氧酯,碳酰二咪唑(CDI) ,溴化氰(CNBr),二乙烯砜(DVS),二氯乙烷磺酰氯(TC),氢化琥珀酰亚胺等。Ubrich等用前五种试剂固定抗体,并比较了固定化抗体的固定量和稳定性 ,以抗体的固定量比较,顺序是DVS>TC> CNBr>CDI>1,4-丁二醇环氧丙氧酯;以在琼脂糖(凝胶)上固定的抗体在实验中的流失情况比较,几种方法的稳定性由弱到强的顺序为:TC<DVS<CNBr<CDI。由于双功能试剂和抗体分子上的自由氨基基团的共价结合是随机的,因此有可能使某些抗体分子的活性位点被封闭[图8-5(a)],这样造成固定化抗体的活性与在溶液中的自由抗体的活性相比有较大损失。为避免固定化过程中抗体空间取向的随意性,减少活性损失,可以采用定向固定的方法。方法之一是将抗体通过其重链(Fc片段)上的糖基基团与载体材料联结,从而使抗体的抗原结合部位暴露[图8-5 (b)]。在固定化抗体时,首先利用高碘酸盐或酶将糖基温和氧化为醛基,然后与活化载体上的酰阱或胺共价结合,将抗体固定。定向固定化的第二种方法是首先利用胃蛋白酶将抗体酶解,分离出F(ab)2片段,然后把单价Fab'片段上的硫化物还原,生成的巯基可以与活化载体反应,从而使抗体被定向固定[图8-5(C)]。第三种定向固定化方法是一种生物固定方法。其原理是首先将蛋白质A或蛋白质G固定在固相载体上,然后将抗体通过载体,由于蛋白质A或蛋白质G可以特异性地与抗体的Fc片段结合,所以抗体被特异性捕获,而位于两个Fab'片段上的抗原结合部位则充分暴露[图8-5(d)]。这种固定化方一法由于条件非常温和,所以对抗体活性的影响非常小,Sisson和Castor的研究表明,经蛋白质A固定化的免疫球蛋白(IgG)几乎保持了全部的免疫活性。另外由于蛋白A或蛋白G与抗体的结合常数非常大(与入IgG和兔馆G的结合常数在4×107~2×108之间),故抗体不易流失。另外,如前所述,最近也有人用溶胶-凝胶包埋的方法将抗体固定化,并已用于多环芳烃(PAHs)的免疫萃取研究。


图8-5 抗体的固定化形式及空间取向

相关链接:固相载体材料的选择

文章来源:《环境样品前处理技术》

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【关键词】溴化氰 蛋白酶 中国标准物质