固相载体材料的选择
来源/作者:中国标准物质网  日期:2019-05-14

用于固定化抗体的固相载体材料的选择是影响免疫萃取柱性能的重要条件之一,一般而言,用于固定化抗体的载体材料应该具有以下特点:①具有化学和生物学稳定性;②表面容易连接-NH2、-COON、-OH等活性基团,即容易被活化;③力学性能强;④颗粒均匀;⑤有较大的孔径(一般在5~400nm);⑥亲水性强,不容易产生非特异性吸附;⑦具有较强的耐压能力,可与HPLC等仪器在线联用。表8-2列举了一些常用的商品化固相载体材料。

表8-2 商品化固相载体材料

这些常用固相载体所用的化学材料主要是:琼脂糖纤维素、聚合物(如:聚甲基丙烯酸酯衍生物,乙烯或聚苯乙烯亲水性有机聚合物等)、硅土、玻璃珠等。在离线免疫萃取柱中以琼脂糖应用较多,它具有化学稳定性强、非特异性吸附少等优点,而且已有商品化的活化琼脂糖出售,比如常见的CNBr活化Sepharose等。

琼脂糖的缺点是机械稳定性差,在高压下容易被压缩变形,因此,以这种固相载体装填的免疫亲和萃取柱不能与HPLC等仪器在线联用。而且这种免疫亲和萃取柱的加样方式一般是依靠重力或在较低的流速下加入样品,萃取时间较长。琼脂糖载体的另一个缺点是生物稳定性差,在储存中容易发生生物降解。

在线免疫萃取中常选用耐压性能较强的硅土、多孔玻璃等作为固相载体材料,其中以硅土最为常用。硅土的孔径一般在5~400nm,具有很强的亲水性,可以和许多种功能基团键合而被活化。常用来活化固相载体材料的化合物如表8-3所示。但是,在使用硅土作为固相载体材料时必须注意使用的pH值范围,因为硅土在碱性条件下不稳定。

表8-3 常用来活化固相载体材料的化合物

Knopp等利用溶胶一凝胶将抗体包埋,制备了可萃取富集PAHs的免疫亲和萃取柱,溶胶一凝胶具有很强的化学及机械稳定性,可以和HPLC等高压仪器联用;由于其具有较大的比表面积和网格状结构,可以允许小分子化合物自由通过,而蛋白大分子则被保留在网格中不易流失。溶胶一凝胶制作过程简单,制备条件温和,有利于在抗体的固定化过程中保持抗体的活性。溶胶-凝胶在内部为抗体提供了亲水性环境,外部则可以防止细菌等微生物的侵入,有助于提高固定化抗体的存储寿命。因此,溶胶-凝胶技术是一个有前途的免疫亲和萃取柱固相载体材料。

整体柱色谱(monolith chromatography)是近年来发展起来的一种快速色谱分离技术。与传统的填充柱色谱相比,整体柱色谱柱压小、分离速度快,这得益于其很高的传质效率。如图8-4所示,整体柱色谱填料上发生的传质过程是以对流为主,而传统柱色谱填充材料上的传质过程以扩散为主,因此,整体柱色谱具有更高的传质效率。整体柱色谱填料包括有机整体柱填料、硅胶整体柱填料、琼脂糖整体柱填料、晶胶(cryogels)等晶胶又称超大孔连续床,由瑞典隆德大学Mattiasson等发明,晶胶是单体或聚合物前体在适度冷冻的溶液中形成的溶胶。这种制备条件下,溶胶形成相互联系的大孔(或超大孔),允许纳米甚至微米粒径溶质的几乎不受阻碍的扩散。这种独特的结构使晶胶具有良好的通透性、化学稳定性和机械稳定性。晶胶既可以制备整体柱,也可以用于制备分离膜材料。

在整体柱色谱填料上固定化抗体后就制成了免疫亲和整体柱色谱,由于目标化合物到抗体抗原结合位点的传质过程大大加快,因此可以显著提高免疫亲和萃取效率。例如,Hage等利用自制的免疫整体柱色谱装置,在3mL·min-1的流速下,仅用100ms的时间就几乎对目标化合物实现完全萃取。一种常用来制备亲和整体柱色谱填料的物质是缩水甘油异丁烯酸酯(GMA)和乙二醇二异丁烯酸酯(EDMA)的聚合物。这种聚合物材料上的环氧基团可以很容易地被转化为二醇,因此具有很强的亲水性,不容易对蛋白或其他化合物发生非特异性吸附。环氧或二醇基团也容易通过多种方式与蛋白质共价结合,从而可用于抗体蛋白在聚合物上的固定。上述利用环氧基团偶联抗体的方法优点是简便易行,但缺点是环氧基团容易水解,因此,对抗体的偶联效率不高。改进的方法包括将环氧键氧化为醛基,然后采用希夫碱法与抗体偶联,或者用碳二亚胺(CDI)或二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)将环氧键活化。

由于整体柱色谱柱压小,可以实现较高的流速,因此可以在较短时间内处理更多体积的样品,同时,由于传质效率高,使用少量洗脱剂在短时间内就可以将亲和吸附剂土捕获的目标化合物洗脱,所以免疫整体柱色谱将可能在环境样品中痕量化合物的免疫亲和萃取与富集中发挥重要作用。但是,整体柱载体与传统载体相比,其比表面积较小,因此其柱容量相对较低,这可能导致这种分析技术的线性范围较窄。


图8-4 常规柱色谱填料与整体柱色谱填料传质机理比较

文章来源:《环境样品前处理技术》

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【关键词】琼脂糖 纤维素 聚苯乙烯 碳二亚胺 中国标准物质