免疫萃取步骤(二)
来源/作者:中国标准物质网  日期:2019-05-14

三、离线免疫萃取

离线免疫萃取(off-line immunoextraction)是相对比较容易与HPLC、GC、CE、ELISA等分析手段实现联用的一种免疫萃取方式。其基本操作步骤是首先将样品通过免疫亲和柱,使分析物被抗体捕获;然后用一定体积的吸附缓冲液冲洗免疫亲和柱,将柱中未与抗体结合的杂质洗出;接着用洗脱缓冲液将分析物从免疫亲和柱上洗脱下来,将洗脱液蒸干,用另一种溶剂将分析物重新溶解、定容或衍生,最后将分析物溶液引入分析仪器进行分析测定。由于离线免疫萃取对固相载体的耐压性要求不高,所以可以选用的固相载体材料非常广泛。尤其是可以使用一些比较常见的商品化活化载体材料,如CNBr-Sepharose、Protein A-Sepharose等对抗体进行固定化,从而使抗体的固定化更容易实现。在免疫亲和柱与气相色谱的联用中,离线免疫萃取方式应用最多。这主要是因为洗脱液往往含有水等强极性溶剂,尤法直接进入GC。另外,对于难挥发或热稳定性比较差的分析物在进入GC之前还需要进行衍生化处理。

在与HPLC的联用中,由于离线免疫萃取方式在选择洗脱缓冲液时不需要考虑其是否与色谱分离柱相匹配,所以可以选择最为理想的洗脱方式,以提高对分析物的回收率,或延长免疫亲和柱的使用寿命。

离线免疫萃取的优点是容易与多种分析手段联用,对柱填料的要求不高,免疫亲和柱的制备相对比较容易;缺点是自动化程度低,费时、费力,测量的精密度也不高,而且由于不可能将定容后的溶液全部注入分析仪器,所以检测灵敏度也有一定程度的降低。

四、在线免疫萃取

提高分析过程的自动化程度是分析化学家追求的目标之一。将免疫亲和萃取及净化过程与分析检测过程实现在线连接(即在线免疫萃取,on-line immuno-extraction)不仅仅是提高自动化程度的间题,它还有助于提高分析方法的重复
性和降低检测限。由于目前在环境分析中主要依靠GC和HPLC以及MS对样品进行分离、定性和定量,所以到目前为止,大多数研究集中在免疫亲和柱(IAC)与GC-HPLC的联用技术。

IAC与HPLC的联用有两种主要方式。相对比较简单的一种方式是将免疫亲和柱与色谱分析柱直接联用,基本连接方式如图8-9所示。由于免疫亲和柱要承受比较高的压力,所以固定化抗体用的载体材料必须是耐压的硅土、多孔玻璃等。比如Pichon等用以硅胶为载体材料的免疫亲和小柱直接与C18分析柱在线联用,对三嗪类和苯基脲类除草剂进行了免疫萃取与测定比州。首先样品通过IAC,分析物与抗体结合,其他组分随麦液排出;然后将阀切换,使IAC与分析柱直接连接,水-乙腈混合溶液以一定梯度流过IAC,将抗体洗脱下来,并进入分析柱进行进一步分离。为保护免疫亲和柱,当乙腈的浓度大于50%时,将阀切换,使溶液不经过IAC而直接进入分析柱,避免固定化抗体因长期暴露于有机相中而变性。免疫亲和柱先后经5mL 70%甲醇和6mL PBS缓冲液恢复后可进行下一次萃取。对于比较脏的样品,免疫亲和柱可以反复使用5。次左右。在一些研究中,洗脱出的分析物还可以在反相柱的顶端进一步浓缩,然后通过梯度提高流动相中有机溶剂的比例,使分析物在反相柱中得到分离。


图8-9 IAC- H PLC联用装置示意图

另外一种相对比较复杂的方式是免疫亲和柱-反相色谱预柱/捕集小柱-分析柱联用方式,系统基本结构如图8-8所示。由于捕集柱还可以对IAC洗脱出的组分起到浓缩富集的作用,所以免疫亲和柱的柱体积可以比较大,这样可以提高单位时间内的样品通量并提高检测灵敏度。另外,它还有助于降低由于柱切换而造成的背景峰。由于洗脱溶液不进入色谱分析柱,所以可以灵活多样地选择洗脱缓冲液,以提高分析效率,延长免疫亲和柱的使用寿命。以琼脂糖为载体材料的免疫亲和柱由于不能耐高压,所以在在线免疫萃取中主要以这种方式与HPLC实现联用。

免疫亲和萃取和HPLC的在线联用现在研究得很多,其中一个主要原因是它可以显著降低样品中难分离基质对分析物的干扰,这样,利用常规的紫外检测器,就可以得到比较高的检测灵敏度。例如,除草剂阿特拉津在土壤中有两种主要的代谢产物:脱乙基-阿特拉津(DEA)和羟基-阿特拉津(OHA),利用常规的反相HPLC柱只能得到土壤提取液中阿特拉津和DEA的峰,OHA的峰受样品基质的干扰很难辨认。而同样的土壤提取液经过阿特拉津免疫亲和柱后,样品基质的影响被显著消除,在色谱图上获得了明显的3种分析物的峰。另外,由于HPLC具有非常精密的泵和注射系统,所以免疫亲和萃取和HPLC的在线联用也可以提高分析的精密度。

由于GC具有很强的分离能力和可以选配多种灵敏的检测器,所以GC是分析多种低沸点化合物的首选。将GC与IAC结合,可以显著降低样品基质对分析的影响,降低GC的检测限。GC与IAC的离线联用已有多篇报道,但是关于IAC与GC在线联用的报道尚不多见。这可能主要是因为IAC的洗脱溶液通常是水溶液或水-有机混合溶液,不适合直接进入气相色谱柱,必须要经过一个溶液转换步骤将水除去,而这一过程一般比较复杂。常用的IAC与GC联用系统的基本连接方式如图8-10所示,从免疫亲和柱洗脱下来的分析物首先通过一个反相色谱预柱。在这里,反相色谱预柱的作用是捕集分析物,并在分析物进入GC之前除去其中的水分。然后,用极性有机溶剂,如乙酸乙酯等将分析物从反相色谱预柱上洗脱下来,进入GC定量阀;最后用GC进行分离和检测。


图8-10 IAC-GC联用系统示意图

文章来源:《环境样品前处理技术》

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【关键词】甲醇 乙腈 乙酸乙酯 中国标准物质