免疫亲和萃取柱的性能评价(一)
来源/作者:中国标准物质网  日期:2019-05-14

一、免疫吸附剂的容量

免疫吸附剂的容量是免疫亲和萃取柱的一个重要评价指标。单位数量免疫吸附剂能够结合目标化合物的总量即为免疫吸附剂的容量。免疫吸附容量的数值可以进行理论估算,例如,对多克隆抗体,首先进行几点假设,即:①纯化的IgG有10%~15%是针对目标化合物的特异性抗体;②在固定化的过程中,抗体的活性没有损失;③固定化抗体的空间取向一致,活性位点充分曝露。在以上三点假设的基础上,根据抗体的结合密度,抗体和目标化合物的分子量,抗体的两价性,根据如下公式,就可以计算出免疫吸附剂的容量。

但是,在固定化过程中不可避免地会有一部分抗体的抗原结合部位因为空间取向、静电屏蔽、化学键合等因素而失去活性,因此实际免疫吸附剂容量要小于理论值:例如.Marx等发现用酰肼化凝胶固定化阿特拉津抗体制备的免疫亲和柱理论容量应为6.2ug·mL-1,而实验测得的容量只有3.8ug·mL-1。免疫吸附剂实际容量难以直接测量,但是可以通过计算结合抗原的最大量来间接估算。

在免疫亲和萃取中,亲和柱萃取的目标化合物可能并非只有一种,而是几种结构相近的化合物,此时免疫萃取柱容量的计算则较为复杂。目前文献中报道的计算方法主要有两种:第一种方法是以一种代表化合物测免疫萃取柱容量,如Shi等用甲苯抗体制备免疫萃取柱,免疫萃取BTEX化合物,用甲苯作为代表化合物测量免疫亲和柱的结合容量;第二种方法是在一定量其他化合物存在下,分别测每一种化合物对应的结合容量。Pichon等用此方法测量了以异特隆抗体制备的免疫亲和萃取柱对苯基脲类除草剂的结合容量,其中,对异特隆的结合容量最高,但仍小于不加干扰物时免疫亲和萃取柱对异特隆的结合容量,这说明其他结构类似物的存在对异特隆与抗体的结合起到了竞争作用。第一种计算方法简单方便,可用于对免疫亲和萃取柱性能的简单估算,第二种方法虽然复杂.但是更接近于样品萃取的实际情况。

另外需注意的一点是,在实际样品测试时,有时个别样品浓度过高,可能超过免疫吸附剂最大容量,由此导致检测结果偏低。尤其用户为了降低检测成本,而对商品化免疫亲和柱反复使用时,一定要注意结合容量降低导致检测结果不准确的风险。

二、回收率

在免疫亲和萃取中,造成分析物回收率(recovery)降低的主要原因是上样过程中分析物没有与固定化抗体充分结合,一部分分析物直接流出免疫亲和柱,从而造成回收率的降低。在合适的反应缓冲液中,分析物与抗体充分结合与否与上样过程中溶液的流速有关。显然,如果溶液流速过高,则分析物与抗体结合的机会就越小。而如果在上样过程中停流一段时间,则目标化合物的回收率会显著升高。另外,分析物与抗体的结合还与抗体对目标化合物的亲和性有关。比如,Houben等用来源于三个不同实验室的多克隆和单克隆阿特拉津抗体制备免疫亲和柱,比较了它们对阿特拉津的回收率。结果显示,德国实验室提供的单克隆抗体具有最高的回收率,达129%,其次为多克隆抗体ELTI,回收率为83%;法国实验室提供的多克隆抗体回收率则非常低。但是,如果将洗脱条件变得更剧烈,例如,将洗脱缓冲液中的甲醇浓度由20%变为70%,则法国实验室提供的多克隆抗体回收率也可达到120%。这说明抗体对目标化合物的亲和力必须适中:亲和力太低,目标化合物难以与抗体充分结合;而亲和力太高又会造成洗脱步骤的困难,二者都有可能造成回收率的降低。

目标化合物的回收率与免疫亲和柱的柱容量有很大关系。如图8-11所示,在样品体积恒定的条件下,增加样品浓度,则目标化合物结合量线性增加。当样品浓度增加到一定程度,固定化抗体上的抗原结合位点被目标化合物饱和,即达到了免疫亲和柱的最大容量,此时目标化合物结合量成一平台。研究表明,在目标化合物结合量线性增加的区域,其回收率为常数,而到达最大柱容量后,由干后来的目标化合物无法与抗体结合而直接流出免疫亲和柱,所以其回收率显著降低。


图8-11 柱容量与回收率关系示意图

由于免疫亲和柱对目标化合物的回收率受其柱容量的影响很大,所以目标化合物的总量应在免疫亲和柱的容量范围以内,这样才能进行准确的定量分析。对于多目标化合物的免疫亲和萃取来说(比如,用固定有抗阿特拉津和西玛津抗体的免疫亲和柱萃取三嗪类除草剂),由于各化合物与抗体的亲和力的不同而导致其对应的柱容量的不同,所以在实际操作中应选用与抗体亲和力最弱的目标化合物来测定免疫亲和柱的柱容量。因为在此容量范围内,萃取的回收率不会受到样品中目标化合物的种类和多少的影响。

三、交叉反应性

免疫亲和萃取柱的交叉反应性(cross reactivity)是指其特异性萃取目标化合物及结构类似的其他化合物的能力。必须注意的是,目标化合物与其结构类似物在免疫萃取柱上的交叉反应性与酶联免疫吸附分析(ELISA)结果不完全相同。多数情况下,化合物在免疫亲和萃取柱上的交叉反应性比在ELISA分析中的结果要高。Stevenson等对异特隆等抗体在ELISA分析和免疫亲和萃取柱上与其他苯基脲类除草剂的交叉反应性作了一系列比较,结果见表8-4。

表8-4 异特隆等抗体在ELISA和免疫亲和萃取柱上对苯基腮类除草剂的回收

化合物在免疫亲和萃取柱上的交叉反应性比在ELISA分析中高的原因可能是因为在ELISA中,过量的分析物竞争少量的抗原抗体结合位点,而在免疫亲和柱中由于柱容量远大于被分析物的量,所以一些相对结合力较弱的被分析物也被保留。从表8-4还发现,在异丙隆抗体免疫亲和萃取柱中,氯草隆与异丙隆抗体的亲和性比异丙隆还要高,另外,Houben等用2,4-D免疫亲和萃取柱萃取氯化苯氧类除草剂时也发现,2,4-D的回收率只有62%,而其他某些氯化苯氧类涂草剂的回收率要比2,4-D高。对于这种现象,目前尚无合理解释,但据推测.这可能是因为在固相载体上抗体的某些特性发生了改变。

虽然免疫萃取柱的选择性会因其柱容量大于分析物进样量的原因而有所降低,但是这仍不失为一种选择性萃取某一组化合物的好方法,因为免疫亲和萃取柱多与HPLC等分析仪器联用,所以萃取后的化合物经洗脱后可以进入HPLC色谱柱而被分离检测。此外,如果采用特异性更强的单克隆抗体,则免疫亲和萃取柱的选择性将会得到改善。

相关链接:免疫萃取步骤(二)

文章来源:《环境样品前处理技术》

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