北京普天同创生物科技有限公司
7.4DNA定量
DNA定量方法按照GB/T 19495.3中相关规定。
7.5 实时荧光PCR检测
7.5.1 实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表2。
表2 实时荧光 PCR反应体系
7.5.2 实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数见表3。使用不同实时荧光PCR仪,可对参数作适当调整。
表3 实时荧光PCR反应参数
7.5.3 仪器检测通道的选择
设置PCR反应管荧光信号收集条件,应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。
7.6 结果分析、判断和表述
7.6.1 基线和闭值的设置
实时荧光PCR反应结束并分析结果时,应设置基线和闽值。基线范围设置在3个~15个循环。基线闭值设置在基线刚好超过正常阴性目标DNA对照扩增曲线最高点且Ct=40,通常情况下可以采用仪器默认的基线阂值,即采用3个~15个循环的阴性目标DNA对照的10倍标准差作为阈值。
7.6.2 质量控制
7.6.2.1 平行样品的设置
每个样品进行实时荧光PCR检测时应设置至少2个平行。
7.6.2.2 对照设置
实时荧光PCR检测过程中应设置PCR扩增试剂对照、PCR扩增阴性目标DNA对照、PCR扩增阳性目标DNA对照,并对DNA提取和纯化过程中设置的核酸提取空白对照同时进行实时荧光PCR检测,具体方式按照GB/T 19495.2中相关规定。实验中设置的各种对照PCR检测结果应符合7.6.2.3~7.6.2.5。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应重做实验。
7.6.2.3 核酸提取空白对照和PCR扩增试剂空白对照
外源基因检测结果Ct≥40,内源基因检测结果Ct≥40。
7.6.2.4 PCR扩增阴性目标DNA对照
外源基因检测结果Ct≥40,内源基因检测结果20≤Ct≤36。
7.6.2.5 PCR扩增阳性目标DNA对照
外源基因检测结果Ct≤36。
7.7 结果判断和表述
7.7.1 待测样品外源基因2个平行样检测结果Ct≥40,内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线,同时各种实验对照结果正常,此时可以判定该样品未检出xxx基因,结果表述为未检出xxx基因。
7.7.2 待测样品外源基因至少1个平行样检测结果36≤Ct≤40并出现典型的扩增曲线,内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线,同时各种实验对照结果正常,此时应适当增加DNA模板量后重做实时荧光PCR检测。再次检测结果外源基因仍然Ct<40并出现典型的扩增曲线,同时各种实验对照结果正常,可以判定该样品检出xxx基因;再次检测结果外源基因Ct≥40,同时各种实验对照结果正常,可以判定该样品未检出xxx基因,结果表述为未检出xxx基因。
7.7.3 待测样品外源基因2个平行样检测结果Ct≤36并出现典型的扩增曲线,内源基因检测20≤Ct≤36并出现典型的扩增曲线,同时各种实验对照结果正常,此时可以判定该样品检出xxx基因,结果表述为检出xxx基因。
文章来源:《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》
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