6 抽样

6.1 采样工具

下列采样工具应经180℃±2℃，2h高温灭菌：剪刀、镊子、扦子。

6.2 样品采集

待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。

6.3 样品储运

样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放入一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。

7 操作方法

7.1 样品模板DNA的制备

7.1.1 在样本制备区进行。

7.1.2 固态食品和饲料中基因组DNA的提取试剂盒。

7.1.3液态食品和化妆品中基因组DNA的提取试剂盒。模板DNA溶液放于冰上保存备用。若长期保存须存放于-20℃或-80℃冰箱。

7.2 检测

7.2.1 扩增试剂准备

在反应混合物配制区进行。为确保检测结果的准确性，在进行实际样品检测时，应设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光PCR反应体系见表1。从牛、羊、猪、牛羊源性成分实时荧光PCR检测试剂盒中取出相应的实时荧光PCR反应用试剂，融化后，2000r/min离心5 s。向每个实时荧光PCR反应管中各分装24 uL反应混合液(除模板DNA外)，转移至上样区。

表1 实时荧光PCR反应体系

7.2.2 加样

在上样区进行。在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液，盖紧管，离心5s～10s。

7.2.3 实时荧光PCR检测

在检测区进行。将本标准7.3.2中离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：95℃/10 s, 1个循环；95℃/5 s, 60℃/20s(24 s、30 s、31 s、34 s),40个循环，在每次循环的退火时收集荧光。检测结束后．根据扩增曲线和Ct值判定结果。

8 结果判定

8.1 结果分析条件设定

直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。

8.2 质控标准

8.2.1 牛、羊、猪源性成分单体系检测阴性对照：有HEX荧光信号检出．并出现典型的扩增曲线，Ct值应小于28.0，而无FAM荧光信号检出。

8.2.2 牛、羊源性成分混合体系检测阴性对照：有HEX荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线。 Ct值应小于28.0，而无FAM和ROX荧光信号检出。

8.2.3 牛、羊、猪源性成分单体系检测阳性对照：有FAM和HEX荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct值应小于28.0。

8.2.4 牛、羊源性成分混合体系检测阳性对照：有FAM, ROX和HEX荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct值应小于28.0。

8.3 结果判定与表述

8.3.1 有效原则

Ct值小于等于35视为有效值，Ct值大于35视为无效值。

表3 对牛、羊混合体系同时检测时结果的判定情况

8.3.3 结果的表述

结果陈述为“检出牛、羊、猪源性成分。”和“未检出牛、羊、猪源性成分。”

9 测定低限

在上述条件下，本方法的测定低限为0.1％。

相关链接：食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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