1 范围

本标准规定了主要食用菌中转基因成分检验的抽样、制样、定性PCR检测方法。

本标准适用于对主要食用菌(杏鲍菇、红菇、姬松茸、香菇、草菇、牛肝菌、鸡腿菇、金针菇、双饱蘑菇、猪肚菇、凤尾菇、小平菇、秀珍菇、猴头菇、金顶侧耳、茶树菇、竹荪、黑木耳、白木耳等)中转基因成分的检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修汀版均不适用于本标准。然而。鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法(GB T 6682-1992 , neq ISO 3696:1987)

SN/T 1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法

3 缩略语

下列缩略语适用于本标准。

3.1

NOS nopaline synthase gene from Agrobacterium tume f aciens

来源于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶基因。

3.2

BAR phosphinothricin acetyltransferase gene from Bacillus amylolique faciens

来源于杆菌Bacillus amylolique facie。草丁磷乙酰转移酶基因。

3.3

GUS β-glucuronidase gene

洛葡糖醛酸酶基因(作为植物基因表达的报告基因)。

3.4

NPT Ⅱ neomycin-3'-phosphotransferase gene

来自人肠杆菌K12菌株的新霉素-3'-磷酸转移酶Ⅱ基因。

3.5

18SrDNA

编码18SrRNA(核糖体)的DNA。

4 原理

样品经过提取DNA后，针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，对外源基因的DNA片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。

5 试剂和材料

除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T 6682规定的一级水。

5.1 2％ CTAB缓冲液：20g/L CTAB,0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0),20 mmol/L EDTA(pH8.0)。

5.2 Tris饱和酚或水饱和酚。

5.3 三氯甲烷。

5.4 异戊醇。

5.5 异丙醇。

5.6 无水乙醇。

5.7 70％乙醇。

5.8 TE溶液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,PH8.0)。

5.9 Rnase A(10 ug/mL)。

5.10 蛋白酶K(20 mg/mL)。

5.11 琼脂糖：电泳纯。

5.12 三羟甲基氨基甲烷(Tris)。

5.13 氯化钠溶液(1.0 mol/L)。

5.14 EDTA(pH8.0)：乙二胺四乙酸。

5.15 10×PCR缓冲液(含25 mmol/L氯化镁)。

5.16 dNTPs溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol/L。

5.17 Taq DNA聚合酶。

5.18 引物：检测转基因食用菌内、外源基因的引物序列及相关信息见表1。

表1 PCR引物与PCR产物

5.19 研究转基因食用菌用的阳性质粒p301-bGl，含有终止子NOS、香菇三磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)基因启动子、目的基因BAR、报告基因GUS等元件，从中提取DNA溶液。

5.20 溴化乙锭(EH) :10 mg/mL。

5.21DNA分子量标准。

5.22 5×TBE缓冲液：Tris 54g，硼酸275 g,0.5 mol/L EDTA(PH8.0)20 mL加蒸馏水至1000 mL。

5.23 6×加样缓冲液(电泳前沿指示剂):0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，30％甘油水溶液(或40％蔗糖)。

5.24 Eppendorf离心管：1.5 mL 2 mL两种规格，用前须高压灭菌处理。

5.25 PCR反应管：200uL、用前须高压灭菌处理。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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