6 检验步骤

6.1 方法提要

食品经处理后，用IMS方法分离纯化隐孢子虫卵囊，再用FTA卡提取DNA，以提取的DNA为模板进行巢式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对食品中隐孢子虫进行快速检验。如有必要，可鉴定到种。

6.2 检验程序

隐孢子虫PCR检验程序见图1。

图1 隐孢子虫PCR检验程序

6.3 检测步骤

6.3.1 食品样品处理

6.3.1.1 对于饮料类样品直接以无菌操作取样品10 mL进行下一步的IMS操作。

6.3.1.2 对于叶类或贝壳类样品称取25 g放入过滤均质袋中，加入100 mL双蒸水，密封后放至摇床上轻轻振荡30 min，将滤液倾倒入2个50 mL离心管中，2000g离心20 min；去上清液，用双蒸水重悬2个50mL离心管中沉淀物及部分上清液，将重悬物转移至另一50 mL、离心管，总体积不得超过10 mL，然后进行下一步的IMS操作。

6.3.2 隐孢子虫卵囊的分离与纯化

将处理好的样品10 mL，用抗隐孢子虫磁珠试剂盒分离纯化隐孢子虫卵囊，其操作参照说明书，最后得到的卵囊悬液进行下一步的DNA抽提。保存剩余分离纯化好的隐袍子虫卵囊，以备确证试验使用。

6.3.3 模板DNA提取

将上述分离纯化好的隐孢子虫卵囊约10 uL滴加到FTA卡上，按FTA卡操作说明书提取模板DNA。所提取的模板DNA，可常温下储存，也可直接放入PCR管中进行后续反应。

6.3.4 巢式PCR扩增(可参照相关试剂盒操作说明)

6.3.4.1 初始PCR (Primary PCR)：反应体系为DNA模板(6.3.3中制得的FTA滤膜片一片)，2×Taq PCR Master Mix 50 uL;1％ BSA 4 uL;10 umol/L 引物各2.5uL；双蒸水41uL。反应条件：94℃预变性4 min; 94℃变性1 min, 54℃退火45 s,72℃延伸1 min，35个循环：72℃延伸8 min。扩增产物长度为1330 bp。

6.3.4.2 巢式PCR(Nested PCR)：反应体系为DNA模板(第一轮PCR产物)) 1 uL, 2×Taq PCR Mas-ter Mix 50 uL；10 umol/L引物各5uL；双蒸水39uL；反应条件：94℃预变性4 min : 94℃变性1min，58℃退火45 s,72℃延伸1 min, 35个循环；72℃延伸8 min。扩增产物长度为830 bp。

6.3.5 质量控制

检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为5.18中所列的隐袍子虫卵囊或适宜的质控隐孢子虫卵囊，阴性对照为非隐孢子虫卵囊，空白对照加入无菌水作为对照。

6.3.6 巢式PCR扩增产物电泳检验

用1×TAE电泳缓冲液配制2％琼脂糖电泳凝胶(嗅化乙锭终浓度达到1.0ug/mL)，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过胶面。将10uL第二轮Nested-PCR扩增产物点样，同时加入100 bp DNA Marker, 9 V/cm恒压，电泳20 min～30 min,紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。

6.4 结果及判断

6.4.1PCR扩增产物电泳检验结果

隐孢子虫PCR扩增产物为830 bp。

6.4.2 结果判断

阴性对照和空白对照均未出现特征条带；阳性对照出现预期大小的特征条带；待测样品出现预期大小的特征条带，怀疑存在隐孢子虫，需进一步确证；待测样品未出现预期大小的扩增条带，为阴性结果。

6.4.3 确证试验

将6.4.2中出现特征性条带对应的卵囊，参照GB/T 5750.12方法进行镜检鉴定。

6.4.4 结果表述

PCR扩增产物电泳检验结果阳性，且经确证为阳性，报告检出隐孢子虫。

PCR扩增产物电泳检验结果阴性，报告未检出隐孢子虫。

6.5 微小隐孢子虫种鉴定

6.5.1RFLP分析

6.4.4中确证为阳性的PCR产物用Vsp、Ssp I限制性内切酶进行酶切。Vsp I限制性内切酶的反应体系为：ddH₂O 2.3 uL，10×buffer 2 uL, BSA 0.2 uL, Vsp I酶0.5uL，第二轮巢式PCR产物15 uL,37℃反应2 h。Ssp I限制性内切酶的反应体系为：ddH2O 7uL, 10×buffer 2 uL, Ssp I酶1 uL，第二轮巢式PCR产物10uL 37℃反应2h。

6.5.2Vsp I ,Ssp I限制性内切酶酶切反应产物电泳检验

操作步骤同6.3.6。

6.5.3 结果表述

经Vsp I酶酶切产物电泳分别得到102 bp、628 bp 片断结果的，报告检出微小隐孢子虫。

经Ssp I酶酶切产物电泳分别得到111bp、254 bp、449 bp片断结果的，报告检出微小隐孢子虫。

经Vsp I酶或Ssp I酶酶切产物电泳未得到102 bp、628 bp或111 bp、254 bp、449 bp片断结果的，报告未检出微小隐孢子虫。

相关链接：进出口食品中隐孢子虫检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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