1 范围

本标准规定犷食品中隐孢子虫的PCR检验方法。

本标准适用于果汁、牛奶、叶类蔬菜及水果、贝壳类中隐孢子虫的快速检验。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 5750.12 生活饮用水标准检验方法微生物指标

GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法(GB/T 6682-2008.ISO 3696:1987)

SN/T 1193 基因检验实验室技术要求

3 定义、术语和缩略语

下列术语、定义和缩略语适用于本标准。

3.1 定义和术语

3.1.1

隐孢子虫cryptosporidium

隐孢子虫为顶端复合体门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美球虫亚目、隐孢子虫科、隐孢子虫属。是直径在(3.2 um～5.1um)×(8.0 um～8.5um)的极微小的，无法以肉眼辨识的单细胞寄生虫。隐孢子虫寄生于人或动物的胃肠道上皮和呼吸道上皮微绒毛，其隐孢子虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病。感染多经过食源性或水源性传播途径感染。目前公认的隐孢子虫有效种为13个种。其中感染人最主要的是微小隐孢子虫(C.purvum)。

3.2 缩略语

3.2.1

IMSimmunomagnetic separation

免疫磁珠分离。

3.2.2

RFLPRestriction Fragment Length Polymorphism

限制性片段长度多态性分析。

4 设备和材料

4.1 电子天平：感量为0.001g。

4.2 显微镜：×100倍。

4.3 离心机：3000r/min。

4.4 恒温水浴锅：36℃±1℃，6℃±1℃。

4.5 PCR扩增仪。

4.6 电泳仪。

4.7 磁极和混匀器。

4.8 微波炉。

4.9 紫外检测仪或凝胶成像系统。

4.10 微量可调移液器：10uL，100uL，200uL，1000uL。

4.11 FTA卡(Whatman公司或同类产品)。

4.12 直径6 mm打孔机(Whatman公司或同类产品)。

4.13 振荡器。

4.14 摇床。

4.15 过滤均质袋(400mL)(法国Interscience,St Nom公司或同类产品)。

5 试剂

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。

5.1 抗隐孢子虫磁珠试剂盒(丹麦Dynal公司或同类产品)。

5.2 DNA抽提试剂盒。

5.3 2×Taq PCR Master Mix[0.1 U Taq Polymerase/uL、500 umol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl(PH8.3)、100 mmol/L KC1、3 mmol/L MgCl₂、其他稳定剂和增强剂]同类产品。

5.4 100 bp DNA marker。

5.5 10 mmol/L Tris-HC1。

5.6 0. 1 mmol/L EDTA(pH8.0)。

5.7 琼脂糖。

5.8 溴化乙锭。

5.9 引物：见表1。

表1 隐孢子虫引物序列及扩增片段长度

5.10 FTA纯化试剂：Whatman公司或同类产品。

5.11 FTA卡洗液TE buffer:0.01mol/L Tris-HCI，pH8.0；0.1 mmol/L EDTA,Whatman公司或同类产品。

5.12 1％ BSA(牛血清白蛋白)。

5.13 0.1 mol/L盐酸(HCl)。

5.14 1 mol/L氢氧化钠(NaOH)。

5.15 TAE电泳缓冲液(储备液50×):Tris碱242g、冰乙酸57.1mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)100 mL，用蒸馏水定容至1000 mL，混匀，室温保存。使用时取20 mL 50×TAE电泳缓冲液，稀释为1000 mL工作液即可。

5.16 VspI限制性内切酶：Promega公司或同类产品。

5.17 SspI限制性内切酶：Fermentas公司或同类产品。

5.18 质控标准卵囊：微小隐孢子虫(Cryptosporidium par-vum)PUS8304、贝氏隐孢子虫(Cryptos po-ridium baileyi)P053、安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni )P052、犬隐袍子虫(Cryptosporidium cant's)PUSS297或适宜的隐孢子虫卵囊。阴性质控菌株为适宜的非隐孢子虫卵囊。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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