4.4 测定步骤

4.4.1 工作液制备

4.4.1.1 杆菌肽标准贮备液

准确称取适量的杆菌肽标准品，用1％ pH 6.0磷酸盐缓冲液配制成100 IU/mL的标准贮备液，于冰箱中保存，可使用一周。

4.4.1.2 杆菌肽标准工作液

吸取一定量杆菌肽标准贮备液，用1％ pH6.0磷酸盐缓冲液稀释成0.15和0.6 IU/mL的工作标准液，以及0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 IU/mL的稀释液，作为制备标准曲线的标准浓度溶液，0.100 IU/mL的稀释液为参考浓度溶液。以上稀释液均须当日配制。

4.4.1.3 菌种培养及菌液的制备

将试验菌种安瓿瓶上部消毒后敲碎，加入少量增菌用培养基(4.3.2.1)溶解后，移入以上培养基中，混匀后于36±1℃培养24 h，再转接至琼脂试管斜面(4.3.2.3)，培养16～18 h，然后加入适量生理盐水，将菌苔洗下，备用。

4.4.2 试液制备：准确称取经纹碎混匀的试样10.0g于均质器内，加入17 mL吡啶溶液(33％)，均质3 min后，移入离心管中离心20 min (3000r/min)。取上清液10 mL，置于另一个离心管内，加入30 mL甲醇充分振摇2 min，再离心20 min (3000r/min )。将上清液移入茄形瓶中，减压浓缩至干，加入3 mL磷酸盐缓冲液(5％)溶解即为样液。此样液中相当于禽肉试样浓度为1.96g/mL。

4.4.3 测定

4.4.3.1 平板制备

于无菌平皿中加入20 mL熔化的基层用培养基(4.3.2.2)，保持水平，待其凝固备用。然后，将锥形瓶中菌种层用培基(4.3.2.3)经熔化并冷却至50～55℃，加入适量的试验菌液(4.4.1.3)使之充分混合后，取4 mL注入上述基层培养基上，保持水平，待其凝固。在测定前应先用0.15 IU/mL标准工作液对该菌液浓度的平板进行预测试，经培养后其标准工作液所呈现的抑菌圈直径在10 mm以上，则该菌液浓度的平板即可使用，否则须调整其菌液浓度，制成合于检定用的平板。

4.4.3.2 标准曲线的制备

可参照SN 0179-92中的6.1

4.4.3.3 检测

每个样品用三个检定平板，在每个平板上，如不需定量时，置4只消毒的牛津杯，对角2只注满样液，剩余的2只杯里分别注满0.6 IU/mL和0.15 IU/mL杯菌肽标准工作液；如需定量时，须置6只消毒的牛津杯，间隔注满样液和0.1 IU/mL杆菌肽标准工作液，于36±1℃培养17±1h。

4.5 结果计算和表述

4.5.1 结果计算和表述

在三个检定平板上，如样液呈出与0.6IU/mL和0.15IU/mL标准工作液相同的清晰抑菌圈时，可用游标卡尺或测量仪进行测量，其抑菌圈平均直径在10 mm以上者为阳性。

对于需定量的实验结果，将分别算出三个检定平板上0.1IU/mL和样液的抑菌圈直径的平均值，经校正后，于标准曲线上查出其抑菌圈直径的平均值所对应的标准浓度值，通过式(1)计算可得出样品中抗生素的含量：

式中：X—样品中杆菌肽的含量，IU/g;

c—从标准曲线上查出样液所对应的抗生素浓度，IU/mL;

m—最终试液所代表的禽肉试样的浓度，g/mL。

4.5.2 结果换算

如果样品中杆菌肽含量的单位要采用mg/kg表示时，可将IU/g按照下述方法进行换算：

标准品中杆菌肽含量＝A IU/mg

样品中杆菌肽含量＝B IU/g

1 IU＝1/Amg＝1/A×10³ ug······(2)

B IU/g=B/A×10³ug/g＝B/A×10³ mg/kg······(3)

式中：A—标准品中杆菌肽含量的数值；

B—依据式(1)计算所得到的样品中杆菌肽的数值。

5 测定低限、回收率

5.1 测定低限

本方法测定低限为0.025IU/g。

5.2 回收率

回收率的数据：杆菌肤添加浓度在0.025～0.100 IU/g范围内，回收率为74.8℃～108.8％。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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