3.4 测定步骤

3.4.1 样液制备

称取20.0g试样于均质杯内，加入20 mL缓冲液Ⅲ(3.2.4)，搅匀，放置60 min，均质2 min(10000r/min)后，移入离心管中离心30 min (4000r/min )。取上清液检查pH，必要时用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.9±0.1，此溶液作为样液。

3.4.2 芽孢悬液的制备

取适量生理盐水(3.2.6)加入已培养好的枯草杆菌63501试管斜面中，制成悬液。取1 mL悬液涂布于装有增菌用培养基的克氏瓶中，置培养箱(36±1)℃培养7天。镜检芽孢数达85％以上，用适量生理盐水洗下菌苔，置于(65±1)℃恒温水浴中加热30 min，经离心(3000r/min)2 0 min，弃去上清液。再加生理盐水洗涤，经离心后弃去上清液，如此重复洗涤芽孢悬液三次。置常温24 h后再置于(65±1)℃恒温水浴中加热3 0 min，然后用适量生理盐水制成芽孢悬液。置4℃冰箱中可保存数月。

3.4.3 芽孢悬液用量的确定

在实际测定前，应先用0.25 ug/mL卡那霉素标准工作液对加有不同量的芽孢悬液的平板进行预测试，经培养后能使0.25 ug/mL标准工作液产生直径≥10 mm清晰、完整的抑菌圈的最佳芽孢悬液用量。

3.4.4 检定用平板

注入10 mL基层培养基于灭菌培养皿内，水平静置，使其凝固。将基层培养基熔化，冷却至50℃左右，加入适量(从3.4.3测得)的芽孢悬液使之充分混合后，取约7 mL注入已铺有基层培养基的平板中，保持水平，使其凝固。所用平板须当天制备。

3.4.5 标准曲线的制备

用卡那霉素标准工作液(3.2.8)制备标准曲线，以0.5ug/mL浓度的标准工作液为参考浓度。每个标准工作液浓度取三个检定平板作为一组，每个平板上置4个牛津杯，使牛津杯在半径为2.8 cm的圆面成90^o角间距，对角两个杯加0.5 ug/mL参考浓度标准工作液，另两个对角杯加其他浓度的一种标准工作液。4个浓度标准工作液共12个检定平板，用于制备标准曲线。其中0.5 ug/mL参考浓度的标准工作液将得到24个数值，而其他标准工作液分别得到6个数值。

将瓦盖盖好，置((36±1)℃培养(17±1)h。经培养后，翻转平板，除去牛津杯，精确地测量各个浓度的抑菌圈直径(精确到0.1mm)，求得各自的平均值，再求出0.5 ug/mL参考浓度24个抑菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值的差，即为各该组平板的校正值。将校正后的值用式(1)和式(2)算出L和H点的直径，在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径为横坐标(算术级)，卡那霉素浓度为纵坐标(对数级)，通过L和H点连一直线即为标准曲线。

L＝(7a＋4b＋c-2d)/10······(1)

H＝(7d＋4c＋b-2a)/10······(2)

式中：L—标准曲线上最低浓度抑菌圈的直径；

H—标准曲线上最高浓度抑菌圈的直径；

b—参考浓度0.5 ug/mL的24个抑菌圈直径的平均值，mm；

a,c,d—分别表示标准曲线中其他标准浓度(0.25、1.0、2.0ug/mL)的抑菌圈直径经校正后的平均值，mm。

3.4.6 样液的测定

每份样液取3个检定平板，在每个平板上置4个已灭菌的牛津杯(按制备标准曲线方法放置)，在对角的2只牛津杯里注满试验样液，在剩余的2只牛津杯里分别注满卡那霉素标准工作液(高稀释度0.25 ug/mL及参考浓度0.5 ug/mL)。于(36±1)℃下培养(17±1)h，然后翻转平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，准确量取抑菌圈直径(精确到0.1mm)。

3.5 结果的计算和表述

如样液抑菌圈的直径＜10 mm,即报告为“阴性”。

如样液抑菌圈的直径≥10 mm，求出每组三个检定平板上样液和参考浓度标准工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出相应的卡那霉素的浓度，通过式(3)，计算试样中卡那霉素残留量：

式中：X—试样中卡那霉素残留的含量，mg/kg ;

c—从标准曲线上查出样液中卡那霉素浓度，ug/mL ;

m—每毫升最终样液所代表的试样量，g。

注：如测定结果呈阳性，即所显抑菌圈直径的平均值≥10 mm时，必要时，尚需进行确证试验(可用薄层色谱法)，以证明抑菌物确系卡那霉素。

4 测定低限和回收率

4.1 测定低限

本方法的测定低限为0.5mg/kg。

4.2 回收率

回收率实验数据：

卡那霉素添加浓度在0.5 ug/g时，回收率为83.7％;

卡那霉素添加浓度在1.0 ug/g时，回收率为91.5％;

卡那霉素添加浓度在2.0 ug/g时，回收率为97.0％。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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