北京普天同创生物科技有限公司
3.3 仪器和设备
3.3.1 液体闪烁分析仪:仪器操作条件是机器运行时,环境温度为15~30℃,相对湿度为30%~80%,确定本仪器地点远离所有的放射源。
3.3.2 绞碎机:电动。
3.3.3 低温离心机:不低于3500r/min。
3.3.4 水浴锅:恒温温度(40±1)℃。
3.3.5 电磁搅拌器。
3.3.6 微量注射器:50~200 uL。
3.3.7 低钾闪烁瓶。
3.3.8 试管:75 mm×16 mm,带磨口玻璃塞。
3.4 测定步骤
3.4.1 提取
称取4g试样(精确至0.1g),置于试管中,加入10 mL无水乙醚振摇20 min后,以3500r/min离心3 min,将提取液转移至另一干净试管中,重复上述操作一次。合并乙醚提取液,于40℃-水浴中蒸发至近干。用4 mL三氯甲烷溶解残渣,然后加4 mL氢氧化钠溶液振摇2 min,静置分层后将氢氧化钠溶液层转移至另一干净试管内,重复上述操作一次。合并氢氧化钠溶液层。加入8 mL正己烷,剧烈振摇,待分层后弃去正己烷层。用磷酸溶液调整溶液pH至7.0。每次用8 mL无水乙醚提取两次,合并乙醚层并蒸发至近干。用1 mL甲醇-磷酸盐-明胶缓冲液溶解残留物,溶液供液体闪烁分析仪测定。
3.4.2 标准曲线的绘制
取18只试管并编号,按下述操作过程制备。
1号、2号管作为测量总T数用。分别依次加入1200uL磷酸盐-明胶缓冲液和100uL己烯雌酚氚标记物工作液(3.2.21)后,于4℃静置12h。
3号、4号管作为测量非特异结合率(NSB)用。分别依次加入700 uL磷酸盐-明胶缓冲液和100 uL己烯雌酚氚标记物工作液(3.2.21)后,于4℃静置12h,加入500 uL分离剂。
5号、6号管作为测量特异结合率(B0)用。分别依次加入600 uL磷酸盐-明胶缓冲液、100uL DES-Ab抗血清和100 uL己烯雌酚氚标记物工作液(3.2.21)后,于4℃静置12h,加入500 uL分离剂。
7~18号管作为标准溶液用。选12.5、25、50、100、200、400 pg/100 uL六个浓度标准工作液,每个浓度用两管。分别依次加入500 uL磷酸盐-明胶缓冲液、100uL标准溶液、100uL DES-Ab抗体和100 uL己烯雌酚氚标记物工作液(3.2.21)后,于4℃静置12 h,加入500 uL分离剂。
以上各管静置30 min后以3500r/min离心20 min,吸取每管全部上清液,放入闪烁瓶内,加入10 mL闪烁液,静置3h后,在液体闪烁分析仪上测定放射性计数。
总T表示标记物在本次实验中的浓度,该浓度应和样液中被测物浓度保持同一水平,如偏离太远,应适当调节试液浓度。
按式(1)计算B/B0值:
式中:B/B0—结合率,%;
B—标准工作液各浓度双管计数均值;
B0—特异结合双管(即5号、6号管)计数均值;
NSB—非特异结合双管(即3号、4号管)计数均值。
求得B/B0(%)值后,以此为纵坐标,各标准工作液浓度为横坐标,在半对数坐标纸上绘制标准曲线。
3.4.3 样液测定
取2只试管,于每只试管中分别加入500 uL磷酸盐-明胶缓冲液,100 uL最终样液,100 uL DES-Ab抗体及100uL己烯雌酚氚标记物工作液(3.2.21)后,于4℃静置12 h,加入500 uL分离剂,以下操作方法与制作标准曲线相同。根据液体闪烁分析仪测定的数据,求得B/B0(%)值,再从标准曲线上查出样液中己烯雌酚的浓度。
3.4.4 空白试验
使用经脱激素肉样,按上述测定步骤进行操作。
3.5 结果计算和表述
按式(2)计算试样中己烯雌酚残留含量:
式中:X—试样中己烯雌酚残留含量,ug/kg;
c—从标准曲线上查得样液中己烯雌酚浓度,ng/mL;
V—样液最终体积,mL;
m—所称试样量,g。
注:计算结果应扣除空白值。
4 测定低限、回收率
4.1 测定低限
本方法的测定低限为0.05ug/kg。
4.2 回收率
牛肉中己烯雌酚添加浓度及其回收率的实验数据:
在0.05 ug/kg时,回收率为86.4%;
在0.10 ug/kg时,回收率为91.7%;
在0.50 ug/kg时,回收率为101.2%。
文章来源:《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》
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