基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片的构建、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。

一、基因芯片的构建

(一)载体

1．载体材料

可用于制作基因芯片的载体材料应包括4类：无机材料、天然有机聚合物、人工合成的有机高分子聚合物和各种高分子聚合物制成的膜及片。但目前适用的材料只有玻璃片、金属片和各种有机高分子制作的薄膜等少数几种，其中玻璃片的应用最为普遍。其原因是来源方便，易作表面处理，能够与探针有效地偶联使之固定。另一个重要原因是大多数基因芯片采用发光检测的方法，不管检测的是透射光还是反射光对玻璃片均适合。为适合扫描仪的测定需要，标准化的玻片尺寸通常制成18mm×73mm。

2．载体活化

载体活化的作用是通过化学反应用各种不同的活化试剂对载体表面进行修饰，使载体表面嵌合上各种活性基团，以便与探针牢固地结合。载体活化的方法很多，用于制备基因芯片常用的活化方法主要是将载体表面修饰成与核酸的羟基能有效偶联的状态。常用的修饰方法为多聚赖氨酸法和醛基一氨基法。前者是由于多聚赖氨酸富集正电荷，易于吸附带负电荷的核酸片段，可以用于固定几百个碱基对的cDNA或PCR产物。后者是由于氨基在中性条件下带正电荷，可同带负电荷的磷酸形成离子键，从而结合DNA，采用UV交联的方法可提高固定率。醛基修饰的玻片是利用Schiff碱结合的原理，即在中性、室温条件下，醛基与DNA上的碱基G、C、A的芳香胺反应形成Schiff碱。

(二)制作方法

1．原位光刻合成法

该法是由美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。其原理是利用光刻合成反应，以经过修饰具有5'末端带光敏保护基团的亚磷酰胺(A、G、C、T)为原料，根据需要合成的核苷酸序列，用特制的光刻掩膜或者用激光定时定点地控制载体上光照的位点，从而指导寡核苷酸探针在片基上的合成，制成基因芯片。其合成过程如下。

①在经过处理的玻片表面铺上一层连接分子(linker)，即使支持物羟基化，并用光敏保护基团将羟基保护起来，加上的光敏保护基团可利用光照射而除去。分别用不同的蔽光膜(光刻掩膜)(photo1ithographic mask)保护不需合成的部位，使其不透光，而暴露需要聚合的部位，使其透光。光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基脱去保护基团而被活化，成为游离羟基。

②按设定的顺序将具有保护基团的亚磷酰胺原料——A、G、C、T中的任意一种铺过片基，进入到活性位点的原料受光照作用，5'末端脱去保护，并与游离羟基结合，从而在片基上连上了第一个某种单核苷酸。更换光刻掩膜和亚磷酰胺原料，同上操作，在不同位点接上其他3种单核苷酸。经过4次上述两步骤，就在片基上按预先设计的方案将4种单核苷酸分别固定在不同的位点上，完成了各个寡核苷酸探针第一位单核苷酸的合成。随后对各固定的单核苷酸羟基加帽、氧化和冲洗，为其羟基加上保护，为下一步骤的合成做准备。至此，芯片寡核苷酸原位合成的第一次循环完成。按同样的方法和步骤进行循环操作，可以合成核苷酸长度等于循环次数的寡核苷酸探针。原位合成含有n个单核苷酸的寡核苷酸片段，需要经过n个循环和4n次上述化学步骤，可以产生4n种可能结构的寡核苷酸探针，几乎可得到全部可能序列组成的探针。

2．机械点样法

利用电脑控制的机械手，按设定的方案将预先合成好的探针、cDNA或基因组DNA准确快速地定量点样于支持物的相应位置上，再用紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。点样量约为5nL／点。每块芯片可含探针点数千至上万个。随着机械和制作水平的提高，点样法制作芯片的密度还可望有较大的提高。

3．喷墨点样法

以定滴供给的方式，通过压电晶体或其他形式从最小的喷嘴内把预先制备好的各种探针点加在片基上不同的位置。其制作的探针点比机械点样法集中和密集，在片基上的附着力也较好，因此可以制作相对较高密度的基因芯片，但喷头的清洗较为困难。

4．分子印章法

其合成原理与原位合成法相似。根据预先的设计在制作好的有凹凸的微印章上涂上对应的单核苷酸，以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域，然后按照顺序逐个依次压印在片基上。在可以自动进行清洗、脱保护、氧化及封闭等化学反应的流体流动池中进行原位DNA合成，直到得到所需的序列的长度。选择适当的合成顺序、设计凹凸位点不同的印章，即可在支持物上原位合成出位置和序列预定的寡核苷酸阵列。分子印章除了可以用于原位合成外，还可以点样方式制作微点阵芯片。

(三)探针制备

基因芯片中所用的探针为核酸分子探针，是指特定的已知序列的核酸片段，能与互补核酸序列发生杂交。因此可以利用探针检测样品中特定基因的特征片段或测定未知基因的序列。根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及寡核苷酸探针等。可以根据检测对象和要求的不同选用不同类型的探针。但并不是任意一段核酸片段均可作为探针。探针选择正确与否，将会直接影响到杂交结果的分析。探针选择最基本的原则是应具有高度特异性，兼而考虑来源及制备的方便等因素。

在基因芯片点阵中，除了针对待检测靶基因片段的主探针群外，还应选择和设计具有检验芯片杂交条件、排除非特异性干扰等功能的辅助探针，如阳性对照、阴性对照、荧光强度测定参照、探针寻址参照等探针。