3 测定方法

3. 1 测定原理

本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应。氯霉素与氯霉素酶标记物竞争数量有限的氯霉素抗体，用酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，氯霉素浓度与吸光度值成反比，按绘制的校正曲线定量计算。

3.2 试剂和材料

除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

3.2.1 乙酸乙酯。

3.2.2 乙腈。

3.2.3 正己烷。

3.2.4 氯化钠溶液：0.5 mol/L，经121℃ 15 min高压灭菌。

3.2.5 半对数坐标纸。

3.2.6 氯霉素酶联免疫定量测定试剂盒。

注：本标准3.5酶联免疫测定步骤中使用的试剂盒为德国r-biopharm公司产品，其他公司等效试剂盒的操作步骤可能略有不同．须经试验评估验证后使用。

3.3 仪器和设备

3.3.1 酶标仪。

3.3.2 均质器。

3.3.3 离心机。

3.3.4 氮气挥发器。

3.3.5 振荡器。

3.3.6 微量加样器：50uL。

3.3.7 微量多通道加样器：50 uL、100 uL。

3.4 试样提取和净化

称取5.00g试样至离心管中，加入15 mL乙腈-水溶液(84+16)，振荡1 min, 15℃ 3000r/min离心20 min。移取3 mL、上清液至玻璃试管中，加入3 mL乙酸乙酯和1 mL氯化钠溶液，振荡1 min，静置分层后去掉下层的水相，有机相用氮气在60℃水浴中吹干，残留物用1 mL试剂盒提供的缓冲液溶解，加入1 mL正己烷振荡1 min, 1500r/min离心10 min，去掉上层的正己烷和脂肪层后供测定用。

3.5 酶联免疫测定

将一定数量的微孔条插入框架(标准液和样液分别做平行试验测定)，记录标准液和样液的位置。

加50 uL氯霉素酶标记物至每个微孔，加50 uL 6个氯霉素标准液(0ng/L、50ng/L、150ng/L、450 ng/L、l350 ng/L、4050ng/L)和样液到各自的微孔，再加50 uL氯霉素抗体至每个微孔，轻拍混匀，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，20℃～25℃黑暗避光处孵育2h。倒掉微孔中的液体，洗板操作6次。加50 uL底物和50 uL发色剂至每个微孔中，轻拍混匀，20℃～25℃黑暗避光处孵育30 min。加100 uL反应终止液至每个微孔中，轻拍混匀后，在10 min内以空气为空白调零，测量并记录每个微孔溶液450 nm波长的吸光度值。

3.6 结果的计算和表述

3.6.1 计算百分比吸光度值

分别计算氯霉素标准液和样液的平均吸光度值，按式(1)求得每个氯霉素标准液和样液的百分比吸光度值：

式中：

A—百分比吸光度值；

S—氯霉素标准液或样液的平均吸光度值；

S₀—0 ng/L的氯霉素标准液的平均吸光度值。

3.6.2 绘制校正曲线

以百分比吸光度值(算术级)为纵坐标，以氯霉素浓度(ng/kg)对数级)为横坐标，绘制出氯霉素标准液百分比吸光度值与氯霉素浓度的校正曲线。每次试验均应重新绘制校正曲线。

3.6.3 结果的表述

在3.6.2绘制的校正曲线上读取样液百分比吸光度值所对应的氯霉素浓度即为试样中的氯霉素残留量(ng/kg)。当测定值小于100 ng/kg时，为氯霉素未检出；当测定值大于等于100 ng/kg时，为氯霉素检测结果阳性，阳性结果须用其他方法进行确证。

4 测定低限、回收率

4.1 测定低限

本方法的测定低限为100 ng/kg。

4.2 回收率

氯霉素添加浓度和回收率实验数据：

100 ng/kg时，回收率为90.7%～108.6％;

1000 ng/kg时，回收率为86.8%-100.6%;

2500 ng/kg时，回收率为91.8%～95.3%。

相关链接：进出口动物源性食品中氯霉素残留量的检验方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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