3.5 酶联免疫法检测

3.5.1 试剂的制备

3.5.1.1 乙酸甲羟孕酮抗体

根据使用需要量，量取一定用量的乙酸甲羟孕酮抗体。用稀释好的抗体缓冲液按照1:50的比例来稀释抗体浓缩液。

注：在吸取浓缩液之前要仔细摇匀，提供的醋酸甲羟孕酮抗体为浓缩液，现用现配。

3.5.1.2 羊抗兔酶标二抗

提供的酶标记物为浓缩液。由于稀释的酶标记物的稳定性不好，仅稀释实际用量的酶标记物。在吸取浓缩液之前要仔细摇匀，用酶标缓冲液按照1：50的比例来稀释酶标记物。

3.5.1.3 底物溶液

由于混合后底物溶液不稳定，需要在显色前临时配置。取等体积的A液和B液混合摇匀使用。

3.5.1.4 洗涤液

提供的洗涤液为10倍浓缩液。使用前用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释10倍使用。

3.5.2 样品测定

在酶标板中分别加入100uL不同浓度的醋酸甲羟孕酮标准溶液和样品待测液；在空白和对照孔中分别加入100uL的抗体稀释缓冲液；除空白孔外，在每个孔中加入50uL才稀释的抗体液；空白孔中则加入50uL才抗体稀释缓冲液；轻拍混匀，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，37℃孵育30 min。弃掉酶标板中的液体，用洗涤液洗板三次。加入稀释好的酶标记物液100uL，轻轻混匀，37℃孵育30 min。弃掉酶标板中的液体，用洗涤液洗板三次。加入混合好的底物液100uL，轻轻混匀，室温放置30 min后，每个孔加入50uL的终止液，轻轻晃动酶标板，10 min内在酶标仪上读出每孔450 nm吸光值。

3.5.3 空白试验

除不称取样品外，均按上述步骤进行。

3.5.4 监控试验

在每次测定均应做一个添加醋酸甲羟孕酮标准的样品，添加浓度为相应产品的检测限量。

3.6 结果的计算

3.6.1 计算抑制率值

计算不同浓度醋酸甲羟孕酮对抗原抗体结合反应的抑制率见式(1) :

式中：

IC—醋酸甲羟孕酮对抗原抗体结合反应的抑制率，％；

A_样品—醋酸甲羟孕酮标准液或样液的450 nm吸光值的平均值；

A_空白—不加入抗体及醋酸甲羟孕酮标准液的450 nm吸光值的平均值；

A_对照—未加醋酸甲羟孕酮标准溶液和样品待测液但加入抗体稀释液和酶标结合物的孔中450 nm吸光值的平均值。

3.6.2 绘制标准曲线

以抑制率为纵坐标，醋酸甲羟孕酮浓度对数为横坐标绘制校正曲线。

3.6.3 结果计算

从标准曲线上读取样液抑制率所对应的醋酸甲羟孕酮浓度(c)，按式(2)计算试样中的醋酸甲羟孕酮残留量：

x＝c×R······(2)

式中：

x—试样中醋酸甲羟孕酮残留量，单位为微克每千克(ug/kg);

c—根据样品孔的抑制率查得试样中醋酸甲羟孕酮浓度，单位为微克每升(ug/L);

R—该样品的稀释倍数，在本方法中该系数均为2。

4 检测低限、回收率

4.1 检测低限

本方法检测低限为1 ug/kg。

相关链接：动物源性食品中醋酸甲羟孕酮残留量的检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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