7.2 测定条件

7.2.1 操作条件

所有操作应在室温下(20℃～24℃)进行，链霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可使用。

7.2.2 洗板条件

人工洗涤次数5次以上，每次加入洗涤液量为250 uL；自动洗板可以预定5次。

7.2.3 酶标仪测定条件

酶标仪测定波长为450 nm。

7.3 测定步骤

7.3.1 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。

7.3.2 吸取100 uL零浓度标准品于孔A1、A2；并吸取50uL奋零浓度标准品于孔B1、B2；分别吸取50 uL链霉素标准溶液(浓度分别为：0.25、0.5、1.0、2.0、10.0、20.0 ng/mL)于孔C1、C2-H1、H2；分别吸取50 uL样品提取液于其余微孔中。测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。

7.3.3 分别吸取25uL、链霉素酶标记物溶液于除A1、A2外的每一个微孔。

7.3.4 分别吸取25uL链霉素抗体溶液于除Al、A2外的每一个微孔。

7.3.5 用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。

7.3.6 将酶标板置于4℃避光温育1 h。

7.3.7 倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干燥。然后立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件进行洗板。要注意不能使微孔干燥。

7.3.8 迅速加入100 uL底物溶液于每一个微孔底部，然后持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光温育30 min。

7.3.9 加入100 uL反应终止液于每一个微孔，然后持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在450 nm处测量吸光度(应在加入反应终止液后30 min内读取吸光度)。

7.4 平行试验

按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。

7.5 空白试验

除不加入试样外，均按上述步骤进行。

7.6 阳性质控

每次测定均应做一个添加链霉素和双氢链霉素标准品溶液(4.8)的监控样品测定，以确定实验过程的操作准确性。

8 结果计算

从标准品和样品的吸光度(OD)值中，减去空白孔A1、A2的平均OD值。标准品和样品的OD平均值除以零标准(B1、B2)的平均OD值，再乘以100。零标准为100％(最大百分比吸光度值)，其他OD值为最大吸光度值的百分数。

以吸光度的百分比值(B/B₀)为纵坐标(％)，链霉素标准溶液浓度(ng/mL)的对数值为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的链霉素浓度后，结果按式(1)进行计算：

式中：

X—样品中链霉素和双氢链霉素的残留总量，单位为微克每千克(ug/kg) ;

c—从标准工作曲线上得到的样品中链霉素和双氢链霉素浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—样品溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL) ;

m—样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克(g)。

也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。所得结果表示至一位小数。

9 确证试验

如被测样品中为阳性结果时，应用其他方法进行确证。

10 本方法测定低限和回收率

10.1 方法测定低限

10 ug/kg。

10.2 回收率

本方法中链霉素和双氢链霉素添加浓度及回收率的试验数据：

a)链霉素

—添加量为10 ug/kg时，回收率为89％～114％;

—添加量为20 ug/kg时，回收率为83.5％～109.5％;

—添加量为200 ug/kg时，回收率为86.4％～101.6％;

b)双氢链霉素

—添加量为10 ug/kg时，回收率为79％～108％;

—添加量为20 ug/kg时，回收率为82％～107.5％；

—添加量为200 ug/kg时，回收率为79.2%～102.8％。

相关链接：进出口蜂王浆中链霉素和双氢链霉素残留量测定方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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