5 仪器和设备

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

5.1 天平：感量为0.1 mg。

5.2 pH 计：精度≤0.01。

5.3 分光光度计。

5.4 涡旋混合器。

5.5 离心机：转速≥2000转/分钟。

5.6 恒温培养箱：36℃±1℃。

5.7 冰箱：2℃～5℃。

5.8 无菌吸管：10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器和吸头。

5.9 瓶口分液器：0mL～10mL。

5.10 锥形瓶：200mL。

5.11 容量瓶（A类）：100mL, 250mL, 500mL。

5.12 单刻度移液管（A类）：容量5mL。

5.13 漏斗：直径90 mm。

5.14 定量滤纸：直径90 mm。

5.15 试管：18mm×l80mm。

注：准备玻璃仪器时，使用活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后要求在200℃干热2h。

6 分析步骤

测试菌液的制备

6.1.1 将莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830）的冻干菌株（4.1）活化后，接种到乳酸杆菌琼脂培养基（4.3.1） 上，36℃±1℃培养24h。再转种2代〜3代来增强活力。置2℃～5℃冰箱保存备用。每15d转种一次。

6.1.2 将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基（4.3.2）中，36℃±1℃培养18h～24h,以2000转/分钟离心2 min～3 min,弃去上清液，加入10mL生理盐水（4.4）,混匀，再离心2 min～3 min, 弃去上清液，再加入10mL生理盐水（4.4）,混匀。如前离心操作，弃去上清液。再加10mL生理盐水（4.4）,混匀。吸适量该菌悬液于10 mL生理盐水（4.4）中，混匀制成测试菌液。

6.1.3 用分光光度计（5.3）,以生理盐水（4.4）做空白，于550nm波长下测测试菌液（6.1.2）的透 光率，使其透光率在60%～80%之间。

6.2 试样的处理

6.2.1 称取无水磷酸氢二钠（4.6）1.3g,无水偏重亚硫酸钠（4.7)1.0g,柠檬酸（含一个结晶水）（4.8）1.2g,用100mL水溶解。

6.2.2 称一定量的样品（精确到0.0001g）,含维生素B₁₂约50ng～100ng,用10mL的上述溶液（6.2.1）混合后，再加150mL水，于121℃水解10min,冷却后调pH至4.5±0.2,再用水定容至250mL,过滤。移取滤液5mL,加入水20mL～30mL,调pH至6.8±0.2,用水定容至100mL。最终溶液中维生 素B₁₂的质量浓度约在0.01ng/mL～0.02ng/mL,偏重亚硫酸钠的质量浓度小于0.03mg/mL。

6.3 标准曲线的制作

按表1顺序加入水、标准曲线工作液（4.9.4）和维生素B₁₂测定用培养基（4.3.3）于培养管中， 一式三份。

表1标准曲线的制作

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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