6.4 待测液的制作

按表2顺序加水、样品溶液（6.2.2）和维生素B₁₂测定用培养基（4.3.3）于培养管内，一式三份。

表2待测液的制作

6.5 灭菌

将6.3和6.4中所有的试管盖上试管帽，121℃灭菌5min（商品培养基按标签说明进行灭菌）。

6.6 接种

将上述试管迅速冷却至30℃以下。用滴管或移液器向上述试管中各滴加1滴（约50uL）测试菌 液（6.1.2）（其中标准曲线管中空白S1除外）。

6.7 培养

将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养19h～20h。

6.8 测定

培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种试管S1内培养液应是澄清的，如果出现浑浊，则测定无效。

6.8.1 以接种空白管做对照，测定最高浓度标准曲线试管的透光率，2h后重新测定。两次结果透光率 差值若小于2%,则取出全部检验管测其透光率。

6.8.2 用未接种空白试管（S1）作空白，将分光光度计透光率调到100% （或吸光度为0）,读出接 种空白试管（S2）的读数。再以接种空白试管（S2）为空白，调节透光率为100%（或吸光度为0）, 依次读出其他每支试管的透光率（或吸光度）。

6.8.3 用涡旋混合器（5.4）充分混合每一支试管（也可以加一滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色 皿内进行测定，波长为550nm,待读数稳定30s后，读出透光率，每支试管稳定时间要相同。以维生 素B₁₂标准品的含量为横坐标，透光率为纵坐标作标准曲线。

6.8.4 根据待测液的透光率，从标准曲线中查得该待测液中维生素Bu的浓度，再根据稀释因子和称样量计算出试样中维生素B₁₂的含量。透光率超出标准曲线管S3～S10范围的试样管要舍去。

6.8.5 对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率计算每毫升该编号待测液维生素B₁₂的浓度， 并计算该编号待测液的维生素B12浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%,超 过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的四个编号的待测液的总管数的2/3,用于计算试样含量 的数据是不充分的，需要重新检验。如果符合要求的管数超过原来管数的2/3,重新计算每一编号的有 效试样管中每毫升测定液中维生素B₁₂含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为 C_x。用于计算试样中的维生素B₁₂含量。

注：绘制标准曲线，既可读取透光率（T%）,也可读取吸光度（A）。

7 分析结果的表述

试样中维生素B₁₂的含量按公式（1）计算：

式中：

X—试样中维生素B₁₂的含量，单位为微克每百克表示（ug/100g）；

C_x—6.8.5中计算所得的总平均值，单位为纳克（ng）；

m—试样的质量，单位为克（g）;

f—稀释倍数。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

8 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

9 其他

本标准检出限为0.1ug/100g。

相关链接：食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定（二）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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