聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction，PCR)具有准确可靠的技术优势，特别是在珍稀贵重中药材的精准鉴定方面具有广阔的应用前景，可应用于生命科学、医学工程、遗传工程、法医学和考古学等领域。本文根据现行版药典详细阐述PCR实验技术DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受环境因素和生物体发育阶段及器官组织差异大的影响，每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此，在传统鉴定方法存在困难的情况下，聚合酶链式反应法突显出准确可靠的技术优势，特别是在珍稀贵重药材的精准鉴定方面具有广阔的应用前景。下面对该法进行详细阐述。

(一) PCR技术原理

聚合酶链式反应(PCR)是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片断技术(又称无细胞分子克隆技术)；它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶促反应，在体外进行特异DNA序列扩增；PCR过程在经过变性、复性、延伸约30个循环就在2小时内可将痕量的靶DNA扩增数百万倍。

PCR技术具有以下特点：特异性强，灵敏度高，产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(10-12)量级的待测模板扩增到微克(10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；简便、快速，一般在2～4小时即可完成扩增反应；对标本的纯度要求低；可直接用标本如细胞、组织等粗制的DNA扩增检测。

PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，其三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用以下公式计算：

Y=(1+X)ⁿ..................(式12-9)

式中，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数；X表示平均每次的扩增效率；n代表循环次数。

如X=100%，n=20时，Y=1048 576倍；平均扩增效率的理论值为100%，但实际扩增效率(X)达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。

尽管PCR的分子标记技术发展迅速，但无论哪种形式的PCR，其基本的过程一般为DNA模板的提取纯化、PCR扩增和凝胶电泳检测三个阶段。

(二) 仪器、实验用具与耗材

1. 仪器PCR仪、凝胶成像仪、高速离心机、分析天平、纯水仪、电泳系统(电泳仪电源，电泳槽及制胶板)、高压蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱、紫外分光光度计、混合球磨仪、微波炉、水浴锅(或恒温混匀仪)、超净工作台、4℃/-20℃冰箱、静音混合器、漩涡混匀器等。

2. 实验用具微量可调移液器(量程ul：2.5，10，20，200，1000)、液氮罐、乳钵、酒精灯、紫外灯等。

3. 耗材1.5ml、15ml、50ml离心管，10ul、200ul、1000ul吸头和0.2ml PCR管，乳胶手套，PE手套，Parafilm封口膜，锡箔纸。

(三) 实验方法

1. 模板DNA的提取纯化

(1) 主要试剂

1)CTAB细胞裂解缓冲液：

十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(NaCl>0.7mol/L)可溶并稳定存在，当降低盐浓度到一定程度(NaCl＜0.3mol/L)时从溶液中沉淀。通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀。CTAB能溶解于乙醇中；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride，Tris-HCl]提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态；乙二胺四醋酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，一般用EDTA二钠盐代替EDTA)是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA；NaCl有利于DNA的溶解；β-巯基乙醇可以防止酚类氧化。

2)SDS细胞裂解缓冲液：

十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)是一种阴离子去垢剂，在高温(55～65℃)条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸。

3) 蛋白酶K：是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。

4) 苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)：苯酚可以使蛋白质变性，同时抑制了DNA酶的降解作用；三氯甲烷可以克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，最后用三氯甲烷抽提能去除核酸溶液中的痕量酚；异戊醇能减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，并有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

5) 70%乙醇：用乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂.

6) 灭菌双蒸水或TE缓冲液：最后再用灭菌双蒸水或TE缓冲液将DNA溶解。

7) RNA酶：是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。

(2) 植物材料：CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法。其原理是采用机械力低温破碎植物细胞，然后加入CTAB细胞裂解缓冲液将DNA溶解出来，再经苯酚-三氯甲烷-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。

将植物组织洗净，用75%的乙醇表面消毒4～5min，用去离子水冲洗3次；将样品放在已灭菌的乳钵中，加入液氮研成粉末，迅速转入1.5ml离心管中，加入600ul CTAB细胞裂解缓冲液或同时加入石英砂研磨，然后转入1.5ml离心管中；65℃水浴温浴1h以上(每20min反转摇匀一次)；加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24：1)或苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24：1)，颠倒混匀；离心(12000rpm)10min，取上清液置新离心管中；重复4，5步骤；向上清液中加入2倍体积的无水乙醇(或2/3体积的异丙醇)沉淀DNA，-20℃放置20min或更长时间，必要时放置过夜；弃去上清液，加200ul 70%乙醇，用吸头将沉淀轻轻挑起，轻轻颠倒离心管几次，清洗沉淀，4℃离心(12000rpm)5min，弃去上清液；重复8步骤；室温挥干至无醇味，加入20～100ul的灭菌双蒸水或TE缓冲液溶解DNA；DNA溶液稀释20～30倍后，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，明确DNA的含量和质量。取2～5ul在0.7% agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。吸取适量用于检测。

(3) 动物材料：取动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于研钵中，加入1ml SDS细胞裂解缓冲液匀浆，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K(500ug/ml)20ul，混匀。55℃水浴温浴60min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次，离心(12000rpm)5min，取上清液置另一离心管中。加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可见丝状物，用100ul吸头挑出，晾干，用200ul TE重新溶解，加等量酚-三氯甲烷-异戊醇(25：24∶1)振荡混匀，离心(12000rpm)5min。取上层溶液至另一管，加入等体积的三氯甲烷异戊醇，振荡混匀，离心(12000rpm)5min。将上层溶液移至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸铵和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，12000rpm离心10min。小心弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉：用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心(12000rpm)5min。小心弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于-20℃保存备用。模板DNA的检测，将模板DNA溶液适当稀释后，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，明确DNA的含量和质量。取2～5ul模板DNA溶液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的分子大小。

目前已有市售植物和动物基因组DNA提取试剂盒，根据样品的特点可选择能满足PCR鉴别试验要求的试剂盒进行提取。

相关链接：中药的DNA分子鉴定技术

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

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