三、实例分析——乌梢蛇

(一) 概述

乌梢蛇饮片在炮制加工过程中，主要鉴别特征几近消失，难以通过外观性状进行准确的鉴定，导致乌梢蛇饮片在商品流通中多有灰鼠蛇、赤链蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇等混伪品出现。2010版《中国药典》，增加乌梢蛇饮片的聚合酶链式反应鉴别方法。线粒体DNA因其种内高度保守性，在动物类药材的鉴别中得到了广泛的应用。乌梢蛇PCR鉴别是采用线粒体基因组中的12SrRNA基因序列，通过特异位点设计乌梢蛇的特异性PCR引物，经过PCR扩增和琼脂糖电泳检测，即可实现对乌梢蛇的准确鉴别。利用鉴别引物5'GCGAAAGCTCGACCTAGCGAAGGGGACCACA3'和5'CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3'可区别于其他蛇类，结果显示只有乌梢蛇在300～400bp范围内扩增出单一DNA条带(350bp)。

(二) 温度与时间的设置

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。

(三) 引物设计原则

1. 引物长度一般为15～30个碱基，常用为20bp左右，引物过短会使特异性降低，过长则增加成本。

2. 引物扩增跨度以200～500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

3. 引物碱基G+C含量以40%～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。碱基最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列以及T在3'末端的重复排列；

避免引物内部出现二级结构、发夹结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；

引物3'末端最好是G或C，但不要GC连排，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

4. 引物的特异性引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。

(四)常见问题分析与对策

1. 假阴性，不出现扩增条带从PCR反应的关键环节模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及PCR循环条件等进行分析研究。

2. 假阳性，出现PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高或出现非特异性扩增带。一是引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体。对策是降低Mg²⁺离子浓度、提高退火温度，减少PCR循环次数、减低酶量、降低引物量，适当增加模板量等。

(五) 所需试剂

动物基因组提取试剂盒，液氮、高保真TaqDNA聚合酶及缓冲液，dNTP Mixture，DNA分子量标记，核酸凝胶染色剂GelRed，琼脂糖，鉴别引物(合成)。

现阶段应用的各种分子生物学技术RAPD、AFLP、ISSR、PCR-RFLP、AR-PCR、SCAR、SRAP、TRAP、ARMS、DNAbarcoding等都不同程度地依赖于目的基因序列的获得，故在中药材基因对照序列库的基础上，将更加充分有效地发挥各种分子生物学技术的优势，使分子鉴定成为中药质量评价的有效手段。随着PCR、DNA测序、核苷酸引物合成、核酸内切酶分离纯化等技术向低成本商业化(试剂盒)、高效率自动化(分析仪器)方向发展，我们有理由期待分子生物学技术成为继显微、理化方法之后中药分析领域又一常规分析方法。

相关链接：PCR技术原理及实验方法（二）

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

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